Главная

Процессы, протекающие через несколько дней: синтез ДНК

Критерием активации лимфоцита служит синтез ДНК, приводящий к митозу. После стимуляции с помощью ФГА или Кон А синтез ДНК (фаза S) может начаться примерно через 36 ч и достигнуть максимума между 48—72 ч, однако в случае других митогенов синтез ДНК может сдвигаться на более поздние сроки. Отсутствие синтеза ДНК служит одним из признаков того, что лимфоцит находится в фазе G0 или G1. Для определения активации лимфоцита митогеном значительно шире используется поглощение клеткой 3Н-тимидина (3H-TdR), хотя, используя этот тест, невозможно отличить транспорт нуклеозидов от синтеза ДНК; TdR фосфорилируется, как только входит в клетку, образуя тимидинтрифосфат, непосредственный предшественник ДНК. Простое улучшение метода, направленное на то, чтобы учитывать лишь поглощение 3H-TdR, прямо связанное с синтезом ДНК, сводится к измерению количества 3H-TdR, включенного в кислотонерастворимые макромолекулы. Тимидин, как предшественник ДНК, для данного метода удобен поскольку он быстро транспортируется из среды в клетку (в то время как его фосфорилированные производные — нет) и содержит единственное основание, обнаруживаемое в ДНК и не обнаруживаемое в РНК. Именно это и является основным преимуществом данного метода.

К сожалению, имеются серьезные сомнения относительно того, что скорость включения 3H-TdR в макромолекулы можно интерпретировать просто как скорость синтеза новой ДНК, поскольку существует много других путей включения 3H-TdR, не связанных с синтезом ДНК. Предположим, что в течение четырехчасовой инкубации в клетки популяции А включилось больше 3H-TdR, чем в клетки популяции Б. Такой результат мог бы отражать различие скоростей синтеза ДНК (как это обычно интерпретируется). Если это действительно так, то все же необходимо провести дальнейшее исследование, с тем чтобы выяснить, характерно ли это различие для большинства клеток или же оно обусловлено существованием небольшой сверхактивной субпощляции клеток А. Однако этот результат может отражать и: а) более высокую скорость транспорта TdR в А-клетки, приводящую к более высокой концентрации меченых предшественников, а также повышение скорости транспорта нуклеозидов при стимуляции митогеном; б) меньшую концентрацию предшественников в А-клетках, что приводит к более высокой относительной концентрации метки, даже несмотря на то, что скорости транспорта в клетках обеих популяций одинаковы: в) различие скорости обмена нуклеозидов и нуклеотидов между разными содержащими их компартментами клетки (например, между цитоплазмой и ядром); г) различие скоростей фосфорилирования нуклеозидов; д) включание, обусловленное вырезанием и репарацией ДНК, а не синтезом новых цепей. После стимуляции с помощью ФГА повышается активность урацил-ДНК-гликозилазы, репарационного фермента, вырезающего любой остаток уридина в ДНК, причем кинетические характеристики работы этого фермента оказываются похожими на соответствующие характеристики классической ДНК-полимеразы; е) наличие любой комбинации перечисленных факторов.

К счастью, несколько авторов получили экспериментальные данные в пользу утверждения, что безотносительно к перечисленным выше возможным ошибкам в интерпретации включение TdR идет параллельно с синтезом ДНК. Тем не менее ряд других авторов до сих пор делает выводы с осторожностью. Используя холодовой гипотонический шок для увеличения проницаемости лимфоцитов человека по отношению к нуклеотидам, Баклей и Уэднер смогли измерить скорость включения 3Н-тимидинтрифосфатов в ДНК по классическому полуконсервативному механизму. Этот метод позволяет избежать всех приведенных выше ошибок интерпретации, за исключением ошибки «д». Авторы подчеркивают, что основные различия в поглощении TdR между инбредными линиями мышей не совпадают с различиями во включении тимидин-трифосфатов и, следовательно, они могут объясняться одной из приведенных причин, а не различием собственно в синтезе ДНК. Бетел и др. с помощью цитофлуориметрического анализа клеток, окрашенных флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым, показали, что между включением TdR в мышиные тимоциты и увеличением количества ДНК в клетке заметной корреляции нет. Акридиновый оранжевый, флуорсцентный краситель, проникает в живые клетки, но в присутствии детергента и при низких значениях рН его поступление в клетку увеличивается. При условии, что РНК гораздо раньше, чем ДНК, переходит под действием хелатирующих агентов в одноцепочечную форму, этот краситель окрашиваает ДНК в зеленый, а РНК в красный цвет. Затем с помощью цитофлуориметрического анализа получают гистограмму интенсивностей красной и зеленой флуоресценции (характеризующих содержание ДНК и РНК) в индивидуальных клетках. По этой гистограмме можно оценить относительное количество клеток в той или иной фазе клеточного цикла.

Цитофлуорограмма популяции лимфоцитов, включающей в себя клетки в различных стадиях клеточного цикла.

С помощью такой цитофлуорограммы можно определить, какая часть клеток популяции находится в той или иной фазе клеточного цикла.
Лимфоциты подвергались пожизненному окрашиванию акридиновым оранжевым, метящим РНК красной флуоресцентной меткой, а ДНК — зеленой. Интенсивность
красной флуоресценции отложена на оси абсцисс, так что точки, расположенные правее, отвечают увеличивающемуся количеству РНК в клетке. По оси ординат,
отложена интенсивность зеленой флуоресценции, так что точки, расположенные выше, отвечают увеличивающемуся количеству ДНК в клетке. Линии, проведенные несколько
произвольно на диаграмме, отделяют клетки, находящиеся в данной фазе клеточного цикла, от других клеток. Клетки, находящиеся в фазе G0,
содержат нормальное диплоидное количество ДНК и минимальное количество РНК. В клетках, находящихся в фазе G1, начался синтез РНК, которая
теперь накапливается, но клетка еще не вступила в фазу S. В фазах G2 и М клетки содержат удвоенное (по отношению к нормальному диплоидному)
количество ДНК, тогда как в фазе S — промежуточное количество. Точки, расположенные ниже нижней горизонтальной линии, соответствующие обломкам клеток, а
также точки, расположенные слева от наклонной линии, соответствующие агрегатам клеток, в данном анализе не рассматриваются.
Результаты были получены на тимоцитах мыши, стимулированных с помощью Кон А.

Было показано, что Кон А увеличивает включение TdR в 10— 20 раз, но, если судить по увеличению количества ДНК, лишь удваивает долю клеток, находящихся в фазах S, G2 или М. При удалении адгезивных клеток включение TdR почти полностью прекращается, хотя доля клеток, находящихся в цикле деления, при этом практически не изменяется. В то же время при добавлении новых адгезивных клеток включение TdR повышается в 25 раз, при том, что процентное содержание клеток, находящихся в цикле деления, лишь удваивается. Поскольку в каждой клетке во время цикла деления количество ДНК может лишь удваиваться, эти результаты свидетельствуют о том, что изменения во включении TdR могут иногда значительно превышать изменения собственно синтеза ДНК.

При использовании описанного выше цитофлуориметрического метода клетки с увеличенным содержанием (ДНК) (т. е. в фазе S, GG2 или М) и клетки с нормальным диплоидным содержанием ДНК, но с увеличенным содержанием РНК (т. е. в фазах GomraGi) относят к «бластам», идентифицируемым по морфологическим признакам.

Copyright © 2011-2012