Главная

Исследования структуры антигенсвязывающих молекул Т-клеточного происхождения

Из предыдущего очевидно, что проведенный функциональный анализ специфичности Т-клеток поставил новые вопросы относительно природы антиген-узнающих Т- клеточных молекул. Являются ли структуры, узнающие свои и тест-антигены, одной или двумя независимыми единицами? Секретируют ли Т-клетки антигенсвязывающие молекулы, и если да, то какое эти молекулы имеют отношение к рецепторам антигена на поверхности клеточной мембраны? Последний вопрос в случае В-клеток оказался довольно простым, так как растворимые формы В-клеточных антигенсвязывающих молекул (иммуноглобулинов) присутствуют в сыворотке в относительно больших количествах. Поскольку иммуноглобулины имеют общие (изотипические) антигенные детерминанты, использование антиизотипических сывороток оказывается важнейшим методом обнаружения мембранных иммуноглобулинов как В-клеточных рецепторов для антигена.

Попытки с помощью антител к иммуноглобулинам показать, что последние служат также для узнавания антигена у Т-клеток, дали противоречивые результаты. Теперь уже ясно, что Т-клетки не синтезируют молекул, имеющих известные детерминанты тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Однако, как обсуждалось ранее, с помощью антител к детерминантам вариабельных районов тяжелых (а в некоторых случаях и легких) цепей иммуноглобулинов можно иден-тифицировать определенные молекулы, присутствующие на клеточной мембране и высвобождающиеся Т-клетками. Являются ли такие молекулы структурами, узнающими антиген?

Не могли ли мы, используя этот подход, не обнаружить тех компонентов, которые специфически связывают антиген, но не несут детерминант, одинаковых с детерминантами В-клеточных иммуноглобулинов?

Возможное решение данной проблемы связано с идентификацией Т-клеточных продуктов, специфически связывающих антиген. Для этого были предложены два подхода. Иммунизированные Т-клетки, как было показано, секретируют растворимые продукты, обладающие антигенной специфичностью и, кроме того, выполняющих во многих случаях иммунорегуляторную функцию.

Т-клеточные антигенсвязывающие молекулы

Источник Форма существования Специфичность Мол. масса (Mr)2 (x l0-3) Наличие антигенных детерминант Эффекторная функция
мемб-ранно-связ-анная секрети-руемая к тест-анти-генам к своим антигенам Igh-V Igh-C IgT-C — с помощью МНС
идио-типи-ческих VH моно-клона-льных антител гетеро-анти-сыво-роток
Т-клетки селезенки (крысы), нормальная сыворотка + + Чужие Ia (свои Ia) 70, (45, 25) +   -   + - Аллореактивность (Лыоис-анти-DA)
Аллореактивные Т-бласты + + то же   70, (62, 40, 25, 15) +   -   + - Аллореактивность
ТНФ-С1-сенсибилизированы Ly1   + ТНФ   68         + - Супрессия ГЗТ
TNBS-сенсибилизированы Ly2   + ?   68     -   - -  
Иммунокомпетентные Ly1   + Эритоциты барана   68 +   -   - - Индукция супрессии по принципу обратнон связи
Иммунокомпетентные Ly1   + Неизв. Igh-V 68 +   -     I-J Супрессия Ly1Th
Иммунокомпетентные Ly2   + Эритоциты барана I-J       -     - то же
Клонированный Ly2-супрессор   +     68 (45, 25)   + -     - Активация В-клеток по ТНФ-инсулину
Клонированный Ly1-хелпер   + Бычий инсулин I-A 45, 33     -     - Активация клеток Ly12 для супрессии ТНФ-КLН-ответа
Т-клеточный гибрид (345—704)   + Инсулин KLH I-J   +   - +   - Вторичное увеличение ТНФ-КLН
  + + ? ?   +   -        
Т-клеточный гибрид (F10) + + KLH               I-J  
Т-клеточный гибрид (258С4.4)   + GAT   25 +   - +   I-At Индуцирует GAT-специфическую супрессию
Т-клеточный гибрид (F12)   + Арс (Igh-псевдо)   +   -     I-J Активирует Ts2 в АрС-специфической супрессии
Т-клеточные гибриды   + НФb-индотип I-J, Igh       - +   I-J Активирует Ts3 в НФ-специфической супрессии
Т-клеточный гибрид   + НФ I-J, Igh       -     I-J TsF3: НФР-специфическая супрессия ГЗТ
Т-клеточный гибрид   + Арс   92           I-J Подавление образования антител при иммунном ответе
Т-клеточный гибрид   + CGG I-A     +       I-A/I-E Фактор индукции
Иммунокомпетентные Т-клетки   + TGAL   30 - 60 + + -     I-A то же
Иммунокомпетентные Т-клетки +   НФ ? 150, 75 + + - + + - Неизвестна
Иммунокомпетентные Т-клетки +   L (Glu60- Ala40) ? 66     -       »
Т-клетки селезенки, тимуса +   Неизв. ? 68 (45, 25)   + -   + - »

Антигенсвязывающие и серологические свойства этих молекул можно выявить с помощью сорбции и элюции на антигенных и (или) аффинных колонках. Некоторые сведения о размере этих молекул удалось получить с помощью биологического тестирования фракций, получаемых методом гель- фильтрации. Кроме того, были проведены опыты, в которых чувствительные к антигену Т-клетки и Т-клеточные гибриды метили путем включения Н- или 853-аминокислот в синтезирующиеся белки, и полученные в результате меченые белки (которые либо секретировались клетками, либо были экстрагированы из них) адсорбировали на колонках с антигеном. Связавшиеся белки затем анализировали с помощью гель-хроматографии или электрофореза в полиакрил- амидном геле. Молекулы, выделенные таким способом, можно, кроме того, проверить на наличие серологических детерминант.

Данные, полученные в результате всех этих исследований, весьма противоречивы. Например, молекулярная масса антиген-специфических молекул Т- клеточного происхождения в неденатурирующих условиях колеблется в интервале от 25 000 до 150 000 Да. Наиболее согласующиеся между собой минимальные значения молекулярной массы этих молекул в восстанавливающих условиях составляют 68 000—75 000 Да, причем они могут образовывать мультимерные комплексы, связываясь между собой с помощью нековалентных и (или) ковалентных взаимодействий. Ни одна из этих молекул не имеет изотипических детерминант, характерных для иммуноглобулинов. В ряде случаев они обладают антигенными детерминантами, сходными с детерминантами вариабельных областей иммуноглобулинов. Среди иммунорегуляторных молекул есть и такие, которые, по-видимому, имеют МНС-детерминанты, однако в сообщениях, опи-сывающих такие молекулы, говорится о том, что эти молекулы не являются антигенсвязывающими. Может оказаться, что несущая МНС-детерминанты молекула придает некую эффекторную функцию находящейся с ней в комплексе антигенсвязывающей молекуле. Возможно, что аналогичная ситуация имеет место при ассоциации В-клеточных иммуноглобулинов с компонентами комплемента, кодируемыми МНС.

Один из наиболее интересных и многообещающих подходов в исследовании Т-клеточных антигенсвязывающих молекул включает в себя выделение таких молекул из Т- клонов и Т-гибридов, которые связывают антиген, процессиро- ванный макрофагом, несущим соответствующие (свои) Iа-антигены. Такой обработанный в макрофаге антиген, по-видимому, имеет Iа-детерминанты, поскольку он сорбируется на колонках с антителами против Ia-белков. Тем не менее следует ожидать, что выделенные из Т-клеток антигенсвязывающие белки будут сорбироваться на колонках с нативным антигеном, а растворимый антиген будет подавлять эту сорбцию. Кроме того, при сравнении эволюционных вариантов тест-антигена относительная прочность их связывания с данными Т-клеточными молекулами должна бы коррелировать с относительной способностью стимулировать пролиферацию клонированных Т-клеток. Результаты этих экспериментов, однако, довольно загадочны. Т-клетки, из которых выделяются белки, не связывают свободного антигена, а свободный антиген не может ингибировать связывание процессированного антигена. Несмотря на это, выделенные антигенсвязывающие молекулы связываются со свободным антигеном с относительно высоким аффинитетом (сродством). В настоящее время нет очевидного объяснения данного парадокса, однако полученные результаты дают основание думать, что Iа-узнающие Т-клетки имеют отдельный связывающий участок, специфичный по отношению к нативному тест-антигену.

Характерная особенность многих из этих антигенсвязывающих белков заключается в их крайней неустойчивости к действию протеиназ. Молекулярная масса основных продуктов расщепления составляет 45 000 и 25 000 Да, что свидетельствует о чувствительности доменов к протеиназам. Из полученных сравнительно недавно результатов следует, что протеолитическое расщепление фактора супрессии требуется для индукции супрессорной функции, осуществляемой фрагментом с мол. массой 45 000 Да, в то время как фрагмент с мол. массой 25 ООО Да обладает специфичностью по отношению к антигену. Кроме того, некоторые клетки могут синтезировать полипептидные цепи с мол. массой 45 000 Да, которые ассоциируют с полипептидами еще большей молекулярной массы, влияя на их биологическую активность. Не исключено, что, подобно иммуноглобулинам, антигенсвязывающие белки Т-клеток имеют разновидности с неодинаковой структурой и различными изотипическими свойствами. К тому же многие из этих белков сильно гидрофобны. Одна из причин столь большого количества отрицательных и противоречащих друг другу результатов, может, в частности, объясняться лабильностью и гидрофобностью изучаемых молекул, что затрудняет их выделение и характеристику.

Поскольку стандартные биохимические подходы к изучению этих молекул оказались слишком трудоемкими и поскольку возможности молекулярно- генетических методов непрерывно растут, именно от последних следует ожидать наиболее интересных результатов.

Copyright © 2011-2012