Главная

Разнообразие

Одна из наиболее интересных проблем, касающихся Ig, — это источники необъятного разнообразия антительных специфичностей и в особенности относительная роль в этом соматических мутаций и разнообразия гаметных генов. Исследования с использованием клонированных генов позволили выявить ряд источников «рекомбинационного» многообразия и получить некоторую информацию о геномных генах V как в их гаметной (и эмбриональной) форме, так и в активно работающих В-клетках.

Один из классических (появившихся до эры клонирования) подходов к выявлению источников разнообразия состоял в том, чтобы оценить полное число генов V в геноме и полное число антител, которое может образовывать организм, и, сопоставив две эти величины, установить, в каком количестве необходимы — и необходимы ли вообще — соматические мутации. Поскольку обе оценки страдали множеством неточностей, этот подход не позволил получить убедительных данных о важности соматических мутаций. Даже информация, полученная с помощью клонирования генов, не позволяет полностью преодолеть эти трудности. В качестве примера такого расчета рассмотрим число антител, которые могут быть образованы 100 гаметными генами VX и 50 генами VH (оба этих числа близки к нижнему пределу оценок числа гаметных генов). Для последовательностей х мы можем умножить 100 (число генов V) на 4 (число активных J-областей) и на 2 (постоянный множитель, отражающий вариабельность в области остатка 96, появляющуюся вследствие «гибкости» системы рекомбинации); в результате получим 500. Для Н-цепей имеем 50 (число генов VH) х 4 (число генов JH) X 12 (число известных гаметных D-областей; возможно, что их число еще больше) х 4 (подвижная рекомбинация с обеих сторон от D); результат составит 9600. Если принять, что ассоциация L- и Н-цепей при образовании полной молекулы антитела L2H2 происходит случайно, то число различных комбинаций составит 800-9600=8-106. Хотя при этой оценке мы пренебрегли разнообразием, возникающим при участии возможных некодируемых «N>-областей, прилежащих к D-областям в рекомбинировавших генах VDJ, а также возможностью изменения рамки считывания в D-областях, она может служить примером того, как природа, позволяя различным элементам рекомбинировать друг с другом, достигает огромного разнообразия, исходя из ограниченного числа одних и тех же нуклеотидов.

По порядку величины эта оценка полного числа различных последовательностей L2H2 совпадает с некоторыми оценками общего числа антител и с первого взгляда устраняет необходимость постулирования соматических мутаций в F-областях. Вывод этот, однако, преждевременен. Одна из трудностей такого подхода состоит в том, что при использованном способе расчета для получения каждой из оценок приходится умножать друг на друга несколько факторов, обладающих достаточно большой погрешностью. При этом погрешность оценки пропорциональна произведению погрешностей, характерных для отдельных факторов. (В самом деле, выбрав другие значения для ряда параметров, в некоторых опубликованных работах пришли к прямо противоположным выводам.) Более того, некоторые из основных допущений, сделанных при расчете, могут оказаться неверными. Маловероятно, например, что каждое из возможных сочетаний L- и Н-цепей дает функциональную молекулу антитела, так как в опытах по реассоциации L—+Н-цепей in vitro гибридные молекулы (образованные L- и Н-цепями, выделенными из разных антител) часто бывают относительно нестабильны. Кроме того, ассоциация V и J (или V, D и J), по-видимому, не полностью случайна. Наконец, оценка общего числа антител обычно основывается на экстраполяции данных, полученных при изучении некоторой доли полного репертуара. Трудно установить, насколько представительна такая выборка (белки миелом, например, во многих отношениях нетипичны). Трудно также представить, как соотносятся между собой и с различиями в аминокислотной последовательности параметры, используемые для различения антител с до сих пор не установленной первичной структурой (картины изоэлектрической фокусировки, тонкая антительная специфичность, анализ идиотипа). Например, две L-цепи, различающиеся по трем аминокислотам, могут образовывать антитела, изоэлектрические точки которых и способность к связыванию антигена могут быть одинаковыми или различными в зависимости от природы и локализации аминокислотных замен. Таким образом, недостатки методов подсчета различимых структур могут сильно затруднить корректное количественное сравнение.

В отличие от подобных глобальных оценок разнообразия изучение отдельных классов Ig, для которых степень разнообразия можно оценить надежнее, позволило получить более убедительные данные о сравнительной роли гаметного разнообразия и соматических мутаций. Результаты анализа аминокислотных последовательностей А,-цепей мыши убедительно свидетельствуют в пользу роли соматических мутаций в создании разнообразия. Так, Кон и др., а также Вайгерт и Риблет проанализировали последовательности цепей М, продуцируемых 21 независимо полученной миеломой, и обнаружили, что 12 из них идентичны. Все остальные варианты оказались уникальными и отличались от последовательности, общей для первых 12 миелом, в основном заменами единичных аминокислот, которые можно, по-видимому, объяснить заменами одного основания (хотя в одном из вариантов были обнаружены две замены, а в другом — три). Важен тот факт, что каждая из замен, кроме одной, была уникальна лишь для одного из вариантов. Авторы пришли к выводу, что общая для 12 миелом последовательность соответствует последовательности единственного гаметного гена, а варианты возникли в результате соматических мутаций. Вывод о том, что общая последовательность соответствует последовательности гаметного гена, был сделан на основании того факта, что появление в результате соматических мутаций одной и той же последовательности 12 раз в 12 независимых миеломах невероятно. Возникновение вариантных последовательностей вследствие соматических мутаций гаметного гена Ы согласуется с тем фактом, что каждый из вариантов наблюдался только однажды, тогда как при появлении таких последовательностей в результате экспрессии других генов λ1 можно было ожидать их неоднократного появления. Сейчас, когда эксперименты по клонированию подтвердили, что ген Vλ1 представлен лишь одной копией, идентификацию вариантов как продуктов соматических мутаций можно считать доказанной. (В действительности уже первый перестроенный ген λ, который удалось клонировать, содержал несколько отличий от гаметного гена.) Следует принять во внимание, однако, одно формальное возражение: мутации, появляющиеся в миеломных антителах, могли возникнуть в результате нефизиологических процессов, связанных со злокачественной трансформацией клеток или их культивированием в лабораториях, что особенно вероятно в случае миелом, поддерживаемых в культуре по многу лет. В литературе описано возникновение таких мутаций в процессе культивирования клеток миелом.

Copyright © 2011-2012