Главная

Геномные клоны Сн

Структура локуса Н-цепей была изучена более подробно после того, как во многих лабораториях удалось выделить геномные клоны генов СH. Как правило, клоны эти были получены при скрининге библиотек геномной ДНК с помощью зондов к ДНК, синтезированных на мРНК миелом. Из множества интересных результатов в связи с ограниченностью места мы рассмотрим лишь некоторые.

Одно из удивительных свойств, присущих всем генам СH, состоит в том, что их функциональные домены, идентифицированные по внутренней гомологии аминокислотных последовательностей и по данным анализа трехмерной структуры (рентгеноструктурный анализ), кодируются в виде непрерывных экзонов, отделенных от других доменов интронами длиной примерно 0,1—0,3 тпн. Так, например, белок γ2b мыши содержит три основных домена (СH1, СH2 и СH3) и небольшой шарнирный домен между СH1 и СH2. Структуру его гена можно суммировать в виде

где цифры в скобках означают число нуклеотидов в каждом сегменте. Интересно, что шарнирный участок гена α кодируется слитно с доменом СH2 без вставочной последовательности (интрона). Анализ геномных генов СH привел к предположению, что в процессе эволюции этих генов могли происходить мутации, уничтожающие и создающие сайты сплайсинга РНК. В результате некоторые из интронных последовательностей могли превращаться в экзоны, и наоборот. Например, последовательность интрона, расположенного с 5'-стороны от шарнирного домена γ2b, в высокой степени гомологична последовательности СH1. Исходя из этого, Такер и др. высказали предположение о том, что экзон шарнирного домена мог возникнуть из полного домена Ig, изменившегося либо в результате исчезновения сайта сплайсинга на 5'-конце домена, либо при возникновении нового сайта сплайсинга в пределах домена.

Результаты анализа структуры гена CH позволили объяснить и возникновение мембранной и секретируемой форм Н-цепей. Как было отмечено ранее, мембрано-связанные формы Н-цепей Ig несколько больше секретируемых форм из-за дополнительного С-концевого гидрофобного сегмента, который, видимо, служит для «заякоривания» белка в мембранном липидном слое. В случае μ,-цепей эти две формы кодируются двумя различными мРНК длиной 2,7 и 2,4 тпн, которые можно разделить с помощью электрофореза в геле. При сравнении последовательностей ДНК геномного клона μ и двух кДНК-клонов, соответствующих этим двум мРНК, в нескольких лабораториях было показано, что оба вида мРНК транскрибируются с одного и того же гена, но сплайсинг их 3'- или С-концевой области проходит по-разному. Нуклеотидная последовательность, кодирующая 20 С-концевых остатков секретируемой формы, содержится в сегменте ДНК, непосредственно следующем за СH4-доменом гена μ, тогда как в мембранной мРНК следующие за CH4-доменом нуклеотиды кодируются двумя экзонами, расположенными примерно на 2 тпн дальше в сторону 3'-конца. Эти мембранные экзоны кодируют 41 остаток, включая 26 незаряженных остатков, которые, встраиваясь в мембрану, закрепляют Ig на поверхности клетки. Согласно современным представлениям, первичный РНК-транскрипт содержит полный локус, включая и 3'-концевые мембранные экзоны; соответствующие последовательности экзонов и интронов удаляются затем в процессе созревания РНК, причем механизм удаления каким-то образом связан с изменяющимися на разных стадиях развития потребностями В-клетки в мембранной или секретируемой формах IgM. Той же общей структурой обладает и ряд других генов СH. Это позволяет предполагать, что механизм альтернативного сплайсинга ответствен за образование двух форм Ig и всех остальных изотипов.

После выделения геномных клонов для всех восьми изотипов Н-цепей мыши были предприняты попытки «связать» их, т. е. проклонировать непрерывно как область ДНК, включающую гены Сн, так и всю ДНК, лежащую между ними. Стратегия этих исследований состояла в следующем: используя клоны кДНК для выделения генов СH, с помощью описанного выше метода «прогулки по хромосоме» просеквенировать и всю некодирующую ДНК, лежащую между генами. В ряде лабораторий удалось «связать» несколько генов СH, а в 1982 г. Шимизу и др. получили клоны, охватывающие область ДНК генома мыши длиной около 200 тпн и содержащие все восемь генов CH. На основании изучения этих клонов была определена следующая структура этой области:

где цифры в скобках указывают расстояния между генами в тпн. Все гены СH ориентированы в одном и том же направлении 5'—3'.

Чтобы выяснить, содержатся ли J-подобные последовательности в каких- либо районах этой области, кроме известного участка вблизи гена (г, зонд, содержащий все известные JH-гены, гибридизовали по Саузерну с клонами, охватывающими полностью все СH-гены. Дополнительных /-последовательностей обнаружено не было. Для того чтобы выявить последовательности, гомологичные генам СH, которые могли бы представлять собой псевдогены, аналогичные опыты были проведены и с зондами из генов СH. Были обнаружены две полосы со слабой перекрестной гибридизацией (отдаленно родственный псевдоген у может существовать с 5'-стороны от гена γ3 и в противоположной ориентации), однако общий вывод сводился к тому, что в изученной области длиной 200 тпн близких по последовательности псевдогенов нет. В этом отношении локусы СH мыши и человека различаются. Большинство генов СH человека было клонировано; оказалось, что они в основном подобны соответствующим генам мыши. В геноме человека, однако, на 3'-конце локуса генов Н-цепей существует большая дуплицированная область, включающая в себя гены α, и ε и, возможно, некоторые из генов γ, расположенных далее в направлении 5'-конца. Одна из дуплицированных последовательностей — это псевдоген, γ которого произошла делеция доменов СH1 и CH2. Кроме того, в геноме человека есть еще одна близкородственная гену ε последовательность — процессированный псевдоген, обнаруженный вне локуса СH и даже в другой хромосоме.

Copyright © 2011-2012