Главная

Геномные клоны

Получение клонов к ДНК х-цепей — источника гибридизационных зондов— позволяет клонировать гены V и С из нелимфоидной геномной ДНК и перестроенные гены V — С из ДНК миелом. Эти геномные гены были немедленно использованы для детального изучения перестроек V — С. Дополнительным стимулом для получения геномных х-генов послужило следующее обстоятельство: сравнение геномных клонов и клонов кДНК для других генов, в частности для генов XL-цепей мыши, выявило совершенно неожиданную особенность геномных клонов, присущую также и х-генам, а именно наличие в них «интронов».

Интронами, или вставочными последовательностями, называют участки ДНК, не представленные в зрелых мРНК (и соответственно не кодирующие аминокислот) и располагающиеся между кодирующими последовательностями геномных генов. В некоторых генах имеется множество интронов, общая длина которых превышает длину кодирующих последовательностей. Функция всех этих некодирующих участков ДНК неизвестна. При образовании РНК-копии гена интроны транскрибируются вместе с кодирующими последовательностями, но затем вырезаются при созревании («процессинге») РНК. В результате первичный РНК-транскрипт превращается в зрелую мРНК. Какие именно особенности первичного транскрипта служат сигналами для того, чтобы вырезание интронных последовательностей в процессе созревания происходило с большой точностью, пока не вполне ясно, однако определение нуклеотидных последовательностей большого числа генов позволило установить, что на концах всех интронов располагаются близкие по последовательности участки. В частности, все интроны начинаются с GT... и оканчиваются на ...AG. Представляло интерес выяснить, имеются ли интроны в геномных генах Ig.

По методическим причинам геномные гены обычно клонируют не в плазмидах, а в бактериофагах. Для этих целей на основе фага К Е. coli сконструирован ряд векторов с повышенной эффективностью клонирования. Процесс клонирования начинают с того, что линейную молекулу ДНК (хромосому) такого «сконструированного фага» расщепляют рестриктазой для удаления центральной области хромосомы, которая содержит ряд генов бактериофага, необходимых для поддержания лизогенного состояния, но не требующихся для размножения фага. Вместо этой центральной области между оставшимися «плечами» ДНК фага X вставляют фрагмент чужеродной ДНК — обычно рестрикционный фрагмент геномной ДНК. Полученные рекомбинантные молекулы ДНК «упаковывают» in vitro в головки фага и таким рекомбинатным фагом заражают газон Е. coli, выращиваемый на чашке с агаром. Каждая из появляющихся прозрачных бляшек содержит потомство одного рекомбинантного фага, несущего один тип вставки, которая таким образом клонируется. Обычно на 10е клонов приходится один клон с нужной вставкой. Для выявления столь редко встречающихся клонов разработаны высокоэффективные методы отбора. Они включают перепечатывание на нитроцеллюлозный фильтр бляшек, появившихся на чашках. Нужную бляшку находят по гибридизации ее ДНК с радиоактивным кДНК- зондом. Из идентифицированной таким образом бляшки можно получить чистую культуру бактериофага, а из нее — большое количество фаговой ДНК со вставкой.

Разработаны две стратегии клонирования, несколько различающиеся по способу приготовления фрагментов геномной ДНК, предназначенных для включения в фаг. При одном из способов геномная ДНК полностью расщепляется рестриктазой, которая, согласно предварительным опытам с блоттингом по Саузерну, дает фрагмент подходящего размера, содержащий нужный ген. Преимущество этого метода состоит в том, что перед упаковкой искомого фрагмента его можно частично очистить с помощью препаративного электрофореза. Поэтому после упаковки требуется проанализировать значительно меньше бляшек для выявления искомого фага. Другой метод включает использование рестриктазы, участки узнавания которой часто повторяются в ДНК. Расщепление, однако, останавдивают после образования лишь очень небольшого числа разрывов. При этом искомый ген будет входить в состав ряда разных фрагментов, длина которых зависит от того, в каком из участков узнавания произойдут разрывы в разных копиях гена. После введения этой смеси фрагментов в фаг получают «библиотеку» клонов, обладающую рядом преимуществ. Одно из них состоит в том, что при последовательном просмотре одной и той же библиотеки можно получить много разных генов, так как этап очистки ДНК, при котором удаляется большое число генов, в этом случае выпускается. Кроме того, при поиске нужного гена в библиотеке обычно получают набор перекрывающихся клонов, суммарный размер ДНК которых больше, чем может вместиться в один клон. Более того, вырезав новый зонд с одного из концов комбинированного сегмента и повторив с помощью этого зонда скрининг библиотеки, можно получить новый набор перекрывающихся клонов и таким образом расширить область клонированной ДНК, прилегающую к искомому гену. Последовательное применение этого метода (называемого также «прогулкой по геному») позволяет получить длинные участки клонированной ДНК, которые могут включать несколько генов.

Copyright © 2011-2012