Главная

Иммуноэлектрофорез. Методика

Материалы и оборудование. Для работы нужно иметь предметные стекла, пробирки с пробками, пипетки (10 мл), очищенный агар или агароза, консервант (например, мертиолят), препаровальную иглу или небольшой шприц с иглой; микропипетку со шлангом и мундштуком или микрошприц (50—100 мкл), фильтровальную бумагу, например, FN 14; NaCl ч. д. а, ледяную уксусную кислоту, амидо черный 10 В, веронал-натрий, NaCH3COO-3 Н20, 0,1 н. HCl; комплект приборов для электрофореза, в который входят источник тока, электрофоретическая камера, штампы, водяная баня, стеклорез, уровень, ванночки для окрашивания предметных стекол.

Приготовление агарового геля

Суспендируют 1,5 г очищенного агара в 100 мл веронал-ацетатного буфера (рН 8,6, ионная сила 0,1), добавляют мертиолят до конечной концентрации 0,1% и нагревают суспензию на водяной бане до полного расплавления агара (раствор становится прозрачным).

Состав буфера:
веронал-натрий —29,43 г
ацетат натрия (ЗН20) — 19,42 г
0,1 М HCl 180,0 мл
дистиллированная вода до 3000,0 мл

Горячий прозрачный раствор агара разливают по пробиркам (заполнять только до половины), закрывают пробками, дают остыть при комнатной температуре и после охлаждения хранят в холодильнике при 4 °С.

Приготовление агаровых пластинок

Тщательно очищенные и обезжиренные предметные стекла надписывают стеклорезом и помещают на горизонтальную плоскость. Несколько пробирок с 1,5% гелем агара нагревают на водяной бане. При помощи предварительно нагретой пипетки (10 мл) на каждое предметное стекло наносят по 2,5 мл горячего золя агара. Раствор агара должен равномерно распределиться по обезжиренной поверхности стекла и после затвердения образовать однородный слой геля.

Юстировочный столик, штатив для пластин и гелевый штамп

Юстировочный столик, штатив для пластин и гелевый штамп

Формирование лунок и канавок в геле

При помощи штампов в слое геля вырезают лунки для антигенов и канавки для антисывороток. Выбор подходящего штампа определяется задачей исследования. Очень удобны штампы с изменяемым профилем. Вырезанные фрагменты геля удаляют иглой или при помощи водоструйного насоса. В образовавшиеся лунки вносят примерно по 2 мкл исследуемого материала микрошприцем. Полоски геля, образовавшиеся после вырезания канавок, также следует удалить до электрофореза, так как после это будет трудно сделать вследствие нагревания геля. Вырезанные фрагменты геля удаляются гораздо легче, если пластинки на 1—2 мин поместить в морозильник.

Проведение электрофореза

Электрофоретическую камеру присоединяют к источнику постоянного тока, выдерживающего нагрузку до 100 мА. Электродные отсеки заполняют веронал-ацетатным буфером с рН 8,6 и устанавливают камеру строго горизонтально по уровню.

Камера для проведения иммуноэлектрофореза с источником питания

Камера для проведения иммуноэлектрофореза с источником питания

Внесение антисыворотки

После электрофоретического разделения белков в продольную канавку вносят 0,03—0,05 мл преципитирующей иммунной сыворотки. Сыворотка не должна переливаться через край канавки, иначе расположение линий преципитации будет искажено.

Иммунодиффузия, элюирование, окрашивание

Иммунодиффузия продолжается не менее 24 ч во влажной камере.

Сосуды для диффузии и элюции. Справа штатив для пластин

Сосуды для диффузии и элюции. Справа штатив для пластин

Затем сразу же начинают элюировать белки, которые не участвовали в преципитации, с помощью 0,15 М NaCl. Элюирование проводят 3 сут с ежедневной сменой раствора. После этого пластины геля накрывают фильтровальной бумагой (не оставляя пузырьков воздуха) и высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40 °С. Для окрашивания белков чаще всего применяют амидо черный 10 В, лиссаминовый (светлый) зеленый, азокармин В или пунцовый 2R. Липопротеиды окрашивают су-даном черным В. При этом важно окрашивать полностью высушенный препарат, так как судан черный В нерастворим в воде и не воспринимается влажным гелем или образует неспецифические осадки. Иммунофореграмма белков сыворотки человека, проявленная полиспецифической антисывороткой кролика, представлена на рисунке.

Иммуноэлектрофореграмма сыворотки человека, проявленная полиспецифической кроличьей антисывороткой

Иммуноэлектрофореграмма сыворотки человека, проявленная полиспецифической кроличьей антисывороткой

Модификация метода

Использование чистых АГ. Иногда одного окрашивания недостаточно для идентификации неизвестного антигена. В этом случае полезно сравнивать исследуемый АГ с известными чистыми АГ. Реагенты располагают так, как показано на рисунке. Различие в электрофоретической подвижности является доказательством неидентичности антигенов.

Идентификация антигенов при помощи чистого АГ: сравнение электрофоретической подвижности

Идентификация антигенов при помощи чистого АГ: сравнение электрофоретической подвижности

Применение моноспецифических иммунных сывороток. Если исследователь заранее предполагает, что в изучаемом образце присутствует какой-либо определенный антиген, он может попытаться идентифицировать его при помощи моноспецифической сыворотки.

Идентификация антигена при помощи моноспецифической антисыворотки

Идентификация антигена при помощи моноспецифической антисыворотки

Линия преципитации, образованная на одной стороне иммуноэлектрофореграммы полиспецифической сывороткой, может слиться с другой линией, которую на другой стороне образует моноспецифическая сыворотка. Такое слияние свидетельствует об идентичности данного компонента антигенной смеси тому АГ, к которому была получена моноспецифическая сыворотка. Однако этот простой и изящный метод идентификации АГ часто бывает неприменим из-за отсутствия соответствующих моноспецифических сывороток.

Метод Оссермана. Для идентификации по Оссерману требуется контрольный раствор, содержащий только известные антигены в возможно меньшем числе.

 Идентификация антигенов по методу Оссермана

 Идентификация антигенов по методу Оссермана

Еще лучше использовать чистые антигены. Контрольный раствор АГ вносят в одну из канавок, и он, диффундируя в сторону канавки с АС, образует линию преципитации, параллельную канавкам. В том месте, где контрольный АГ встречается с идентичным компонентом исследуемой смеси антигенов, линия преципитации искривляется и переходит в дугу идентичного антигена. Четкая картина получается лишь тогда, когда контрольный раствор содержит минимальное число известных АГ. В противном случае на иммуноэлектрофореграмме возникает множество беспорядочно расположенных полос и дуг, интерпретировать которые трудно или даже невозможно.

Метод Гереманса. В основе метода Гереманса лежит реакция двух различных АГ с антисывороткой, содержащей АТ (антитело) к ним обоим. Исследуемый АГ сравнивают с контрольным по электрофоретической подвижности и одновременно проводят реакцию на иммунологическую идентичность. С этой целью в канавке для АС оставляют агаровую перемычку, положение которой определяется в предварительном опыте. Поэтому метод Германса называют также «методом разделенной канавки».

Идентификация антигенов по методу Гереманса

Идентификация антигенов по методу Гереманса

Перемычка должна находиться в том месте, где ожидают слияния полос преципитации исследуемого и контрольного АГ (в случае их идентичности). Если по обе стороны перемычки будут находиться идентичные или перекрестно реагирующие АГ, произойдет полное слияние дуг преципитации или (при неполной идентичности) образование шпоры.

Copyright © 2011-2012