Главная

Разделение клеток методом цитолиза

Иммунологическими исследованиями установлено, что поверхность клетки состоит из различных антигенов. К ним относятся трансплантационные, дифферецировочные, тканеспецифические, мембранные антигены, обусловливающие серологические различия разных типов клеток и тканей. У лимфоцитов мыши, первого хорошо изученного вида, было обнаружено большое количество дифференцировочных антигенов. Наиболее важны для разделения клеток 6-антигены и антигены лимфоцитов Lyt 1, 2, 3 (Т-клетки), MBL А (В-клетки), а также и мембранные глобулины, концентрация которых на поверхности Т-лимфоцитов лежит ниже границы чувствительности в тесте цитотоксичности. Антигены Leu 1, 2а, 2b и 3, являющиеся эквивалентами антигенов Lyt, описаны также у человека. Кроме того, специфические антигены плазматических, стволовых, цитотоксических и NK-клеток были обнаружены не только у мыши, но также у других подопытных животных и у человека. Подробное перечисление этих антигенов выходит за рамки настоящей работы; большая часть этих антигенов имеет значение только для специальных исследований. Разделение клеток при помощи цитолиза представляет собой препаративную форму цитотоксического теста, предложенного в 1956 г. Горером и О'Горманом. Клетки, которые были инкубированы с антителами к мембранным антигенам, лизируются после добавления комплемента. Количество лизированных клеток определяют путем подсчета, в случае использования соответствующих приспособлений нелизированные клетки можно получать в препаративных количествах.

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: MEM, сыворотка плода коровы, центрифужные пробирки, настольная центрифуга, термостат или водяная баня; микротитраторы Takatsy, гемоцитометр, трипановый синий, ПАФ, шприцы, антисыворотки, комплемент.

Иммунизация. В литературе описано большое количество различных схем иммунизации. Часто делают попытки получить сыворотки с особенно высокими титрами антител, для чего применяют высокие дозы антигенов и частые повторные иммунизации. Следует учитывать иммуногенность антигенов, поскольку большие дозы антигенов с выраженной иммуногенностью могут приводить к результатам, противоположным ожидаемым. В гетерологических системах общим правилом должно стать использование по возможности малых доз антигенов в сочетании с длительными интервалами между их введением (2—4 недели). Такая схема приводит, как правило, к получению сывороток хорошего качества.

В сингенных системах с низкой иммуногенностью антигенов оптимальная доза намного выше. Использование ПАВ позволяет улучшить результаты иммунизации. Первый раз антитела вводят по возможности в подколенный лимфатический узел, в последующие разы — подкожно, внутривенно или внутрибрюшинно. Внутримышечное введение антигенов с адъювантами часто вызывает образование абсцессов и не дает никаких реальных преимуществ (смотри раздел "Получение антисывороток от различных животных").

Анти-тэта-сыворотки. Анти-Thy 1.1 (тэта-AKR)-сыворотка: СЗН-анти-АКД-тимус Анти-Thy 1.2 (тэта-СЗН-анти-АКН-тимус)-сыворотка: AKR-анти-СЗН-тимус. Суспензию тимоцитов (40Х106/мг) по каплям вносят в равный объем полный адъювант Фрейнда и перемешивают до получения стабильной водно-масляной эмульсии. По 0,02—0,03 мл этой эмульсии вводят в каждую заднюю лапу, т. е. примерно по 1Х106 тимоцитов на мышь. Последующие инъекции следуют с интервалом 2—3 недели, мышам при этом вводят по 5Х106 клеток в объеме 0,2 мл внутрибрюшиино. Первый отбор крови проводят через одну неделю после последней иммунизации. В среднем необходимы 3 иммунизации; с каждой мыши получают 0,2—0,3 мл сыворотки. Как правило, адсорбцию проводить не приходится. В особых случаях рекомендуется проводить адсорбцию сывороткой или клетками особей того же биологического вида. При проведении адсорбции сывороткой полученную АС смешивают с равным объемом нормальной сыворотки «донора» антигена и инкубируют в течение 30 минут при 37 °С.

Крысиная антисыворотка к тимусу мышей. В соответствии с предыдущим разделом тимоциты мышей (СВА, 50Х106 клеток/мл) смешивают с полный адъювант Фрейнда и вводят крысам Вистар по 0,1 мл в каждую заднюю лапу (т. е. по 5,0Х106 клеток на крысу) подкожно. Однократный (!) забор крови проводят через 9 дней. От каждой крысы получают до 3 мл сыворотки.

Адсорбция. Поскольку образование антител против антигена, обусловливающих различие систем гистосовместимости крысы и мыши, начинается тогда, когда титр антител к тимусным антигенными уже относительно высок, то, как правило, достаточно одно- или двукратной адсорбции сыворотки мышиной печенью.

К 5 мл разведенной в соотношении 1 : 5 сыворотки добавляют 0,2 г однократно отмытого ацетонового порошка мышиной печени, что соответствует 1 г свежей печени. Адсорбированная сыворотка способна вызывать гибель в цитотоксическом тесте 99—100% тимусных клеток, 38% клеток селезенки, 50—60% клеток лимфатических узлов, но не приводит к гибели клеток костного мозга у мышей СВА.

Кроличья антисыворотка против В-лимфоцитов мыши. 1 этап: мышей иммунизируют, вводя внутрибрюшинно по 0,2 мл 25% суспензии ЭБ. Кровь берут через 5 дней. Получают АС к эритроцитам барана (IgM), обязательно инактивируют комплемент (30 минут при 37°С). 30 минут при 37 °С. Клетки осаждают с 3 мл АС (1 этап) 30 минут при 37 °С. Клетки осаждают центрифугированием и 2 раза отмывают ФСБ. Готовят смесь с полный адъювант Фрейнда Кролику подкожно ниже подколенного лимфатического узла вводят по 0,5 мл препарата в каждую лапу. Через 3 недели проводят 2-ю инъекцию подкожно в верхнюю часть бедра и еще через 3 недели такую же дозу (без ПАФ) вводят внутрибрюшинно. Спустя 14 дней берут первую пробу крови из вены. Еженедельно без ущерба для здоровья животного можно отбирать до 60 мл крови, а при больших интервалах — до 90 мл (кровь берут из ушной вены). Неадсорбированная сыворотка, помимо В-лимфоцитов, вызывает гибель приблизительно 50% Т-лимфоцитов в лимфатических узлах, селезенке и тимусе, что, вероятно, связано с наличием антигена Форссмана в Т-лимфоцитах мыши. После 2—4-кратной адсорбции эритроцитами барана сыворотка реагирует только с В-лимфоцитами (57% — лимфоциты селезенки, 30%—лимфатических узлов, 0%—тимуса, 9%—костного мозга). Для адсорбции неразведенную инактивированную сыворотку смешивают с равным объемом 60% суспензии эритроцитов. После 3—4-кратного повторения достигается необходимая конечная концентрация, вызывающая цитолиз.

Комплемент. Источником комплемента служит нормальная сыворотка кролика или морской свинки. Поскольку эти сыворотки в основном цитотоксичны, и, кроме того, активность комплемента может варьировать, их следует исследовать в сравнении с известной АС и субтоксическими дозами комплемента в цитотоксическом тесте. Сыворотки, содержащие активный комплемент, объединяют для получения стандартного препарата. Слаботоксические сыворотки можно адсорбировать агаром или агарозой. Обычно достаточно 20 мг агара для адсорбции 1 мл комплемента, разведенного в соотношении 1 :3. Адсорбцию ведут при 0—4°С, длительность процесса 60 минут. Каждые 10 минут смесь перемешивают, а после окончания инкубации — центрифугируют. Объединенный препарат комплемента разделяют на небольшие порции, быстро замораживают и хранят при —30 °С (и ниже). Для проведения пробы на цитотоксичность допустимо только однократное размораживание комплемента.

Определение цитотоксичности сывороток. Для определения специфичности сыворотки и эффективности-адсорбции лучше всего использовать тест на цитотоксичность. Проще всего это сделать следующим образом: в лунки микротитратора (или маленькие пробирки) вносят по 20 мкл суспензии клеток (2Х106/мл), 20 мкл сыворотки (ряд разведений) и 20 мкл комплемента, инкубируют 45 минут при 37 °С, добавляют 20 мкл трипанового синего и подсчитывают количество живых клеток. При работе с каждой суспензией клеток ставят двойной контроль антисыворотки. Подсчитывают клетки на равной площади поверхности камеры (например, 1/3 поверхности камеры Burker), в контроле (только комплемент, только АС или только сыворотки плода коровы) должно содержаться 150—200 клеток. Этот метод так же точен, как и общепринятая методика, но он имеет два преимущества:

1) результаты получаются быстрее,

2) количество мертвых клеток в исходной суспензии не имеет значения в случае избытка антител.

Необходимое разведение комплемента желательно определять заранее. Обычно для проведения цитолиза клеток селезенки или лимфатических узлов мыши комплемент (морская свинка) не разводят, а для цитолиза мышиных тимоцитов делают разведение в 3 раза.

Количественный цитолиз. Берут 1 объем клеток (100Х106/мл), 2 объема антисыворотки 1 объем комплемента.

Смесь инкубируют в течение 60 минут при 37 °С, каждые 10 минут встряхивают, центрифугируют, дважды отмывают средой MEM с 5% телячьей сыворотки, погибшие клетки отфильтровывают.

Оценка метода

Разделение клеток путем цитолиза — наиболее простой из всех методов при условии наличия необходимых сывороток. Метод позволяет за короткое время разделить большое количество клеток. Выделенные клетки можно рассматривать как нестимулированные. Могут наблюдаться артефакты, хотя и редко, в тех случаях, когда АС не обладает нужной специфичностью. Не следует ожидать, что подлежащая элиминации субпопуляция клеток будет лизирована на 100% (эффективность цитолиза зависит от качества сыворотки и от концентрации АГ на поверхности .клеток-мишеней), к тому же никакой другой метод не дает 100% чистоты выделяемой субпопуляции. Еще одним преимуществом является возможность разделения В- или Т-лимфоцитов на субпопуляции, что невозможно осуществить большинством других методов.

В настоящее время большая часть моноспецифических АС, в том числе моноклональных антител, выпускается в виде коммерческих препаратов. Самостоятельно получить и охарактеризовать сыворотки для цитолиза довольно просто, но необходим известный опыт, чтобы полученные АС специфически и в достаточной степени элиминировали нужную субпопуляцию клеток.

Copyright © 2011-2012