Главная

Разделение клеток на аффинных колонках

Аффинная сепарация основана на избирательной сорбции клеток различных субпопуляций носителями, содержащими вещества, к которым клетки данной субпопуляции имеют высокое сродство. Связывание может быть обратимым или необратимым. Специфически реагирующими компонентами клеточной мембраны могут служить мембранные Ig, а также рецепторы комплемента (СЗ), Fc-фрагмент антител, антигены, лектины, гистамин. В качестве носителя для агтигенов, антииммуноглобулина или комплексов антиген-антитело первоначально служит стекло или дегалан. Поскольку неспецифическое связывание у стекла или дегалана довольно сильно выражено, разделение клеток лучше проводить на материалах со слабым неспецифическим связыванием. К этим материалам относятся гранулы из сыворотки телят, сефадекс, сефароза, биогель (полиакриламид) и сферой (гидроксиалкилметакрилатный гель). В зависимости от условий опыта связывающая способность биогеля колебалась от 40% до 0. Привязывание к биогелю азофенил-β-лактозы или ДНФ позволяло с высокой эффективностью выделять антителообразующие клетки к этим гаптенам. Присоединение к носителям белков, таких как антииммуноглобулин, представляет известные трудности и при этом не делает процесс разделения клеток достаточно эффективным.

Нагруженный антигеном сферой удерживает до 60% антителообразующих клеток, однако элюцию клеток невозможно проводить свободным антигеном, как при использовании биогеля. Ниже приведены еще несколько методов:

а) агглютинин Helix pomatia (НРА) связывает обработанные нейраминидазой Т-лимфоциты человека. Через колонки с НРА-сефарозой поэтому в первую очередь проходят В-лимфоциты. Т-лимфоциты элюируют N-ацетил-D-галактозамином;

б) нагруженным антигеном желатином покрывают центрифужные пробирки фирмы Falcon. Расплавление желатина, наступающее при 37 °С, высвобождает антителообразующих клеток, ранее связанные с желатиновым слоем (обогащение до 30 раз);

в) протеин A Staphylococcus aureus реагирует с Fc-участком IgG. Монослой эритроцитов, нагруженных протеином А, связывает благодаря этому клетки, содержащие антитела. При помощи гипотонического шока или лизостафина эти клетки можно снова получить в свободном виде;

г) В-лимфоциты мыши связывают через Fc-рецепторы с монослоем эритроцитов, нагруженных антителами (например, комплекс антиген-антитело). Свободные В-лимфоциты получают при помощи гипотонического шока. Чистота разделенных данным методом Т- и В-лимфоцитов достигает 90%.

Материалы и оборудование

Получение суспензии клеток. Для работы необходимы: ФСБ, MEM с 5% сывороткой телят (рН 7,2), колонка с термостатируемой рубашкой, лиофилизированная телячья сыворотка; 25% глютаровый альдегид, 1,0 М фосфатный буфер Серенсена с рН 7,0, эфир, этанол 96%, сухой лед, 0,1 М уксусная кислота, 0,3 М бикарбонатный буфер с рН 10,0, мышиный глобулин, антисыворотка против мышпнс-го глобулина, сефадекс G-200, бромциан, борат-PPS с рН 8,0, антисыворотка к IgG человека, Fab-фрагменты Ig человека, IgG человека, NaOH, ЭДТА, сефароза 4В для разделения, нормальная сыворотка человека, дегалановые и стеклянные гранулы 100— 500 мкм в диаметре.

Выделение Т-лимфоцитов путем элиминации В-лимфоцитов на протеиновых гранулах, нагруженных комплексами антиген-антитело

Для получения белковых гранул используют лиофилизированную телячью сыворотку (ТС). Порошок, полученный из 5,0 мл телячьей сыворотки (15 г/100 мл), смешивают с 0,5 мл 1 М буфера Серенсена с рН 7,0 и 0,18—0,20 мл 25% глютарового альдегида и тут же при постоянном перемешивании выливают в охлажденный эфир (смесь этанол — сухой лед; —60 °С). Точное количество глутарового альдегида должно быть таким, чтобы полимеризация белка завершалась в течение 45—60°С. Замороженные белковые гранулы в плоском сосуде с крышкой в течение нескольких часов выдерживают на холоде. В ходе длительного оттаивания процесс полимеризации белка завершается. По консистенции все еще довольно мягкие гранулы переносят в этанол, где остатки эфира экстрагируются, а гранулы приобретают необходимую твердость.

На величину получаемых гранул можно воздействовать снижением концентрации белка (до 10—12%), более быстрым перемешиванием и более быстрым впрыскиванием материала. Получаемые гранулы просеивают в виде суспензии в этаноле через пластмассовые бусы.

Схема получения белковых гранул (носитель для колоночной хроматографии)

Схема получения белковых гранул

Гранулы более 1 мм в диаметре отбрасывают. Для присоединения комплексов антиген-антитело к гранулам их (свежеполученные или уже использованные) отмывают ФСБ, затем активируют 25% раствором глутарового альдегида в ФСБ, инкубируют еще 2 ч с глобулином мыши или крысы (3—4 мг/мл) и 2 ч с соответствующим антиглобулином, например с 3 мл разведенной 1 :5 АС на 50 мг гранул. Используемая АС должна давать заметные линии преципитации в пробе Ухтерлони в разведении 1:8—1:16. После инкубации гранулы отмывают 5-кратным объемом ФСБ. Для разделения лимфоцитов используют колонки объемом 1,5x30 см, объемом 50 мл (на 100х106 клеток) или 2,5X30 см, объемом 150 мл (на 300—400х106 клеток).

Гранулы, колонки и разделяющую среду (MEM с 5% телячьей сыворотки) перед разделением прогревают до 37 °С. Перед нанесением клеток колонку промывают двумя объемами разделяющей среды и дают уровню среды установиться по верхнему краю носителя. Со скоростью 3 мл/мин на колонку наносят суспензию спленоцитов мыши — 100x106 в 17 мл или 300—400х106 в 50 мл; колонку инкубируют 30 минут при 37°С. Удаление несвязавшихся клеток осуществляют пропусканием через колонку 2—3 объемов разделяющей среды со скоростью 2—3 мл/мин. Белковые гранулы регенерируют 0,1 М уксусной кислотой, ФСБ, 0,2 М карбонат-бикарбонатным буфером с рН 10 (по 10 мин каждым раствором) и снова ФСБ. После нагрузки гранул антигенов их можно использовать 3 раза, причем не рекомендуется одни h те же гранулы нагружать различными белками. В качестве альтернативы приходится прибегать к очистке гранул трипсином. Гранулы остаются стабильными в 50% этаноле при 4°С в течение 8 ч.

Разделение Т- и В-лимфоцитов человека на анти-Fab-сефадексе

Сефадекс с размером частиц не менее 90 мкм в диаметре в количестве 1 г кипятят в дистиллированной воде и доводят рН до 10,3—10,5 20% NaOH. После прибавления 100 мг бромциана рН снова подводят до этой величины добавлением по каплям NaOH и выдерживают смесь в течение 10 мин. Активированный сефадекс отмывают борат-ФСБ буфером с рН 8,3 и немедленно прибавляют 24—30 мг очищенных антител против Fab-фрагментов человека и перемешивают в течение 4 часов. После повторной отмывки 8—10 мл нагруженного сефадекса в разделяющей среде (MEM + 5% телячьей сыворотки + 2,5 мМ ЭДТА) вносят в небольшую колонку или шприц, инкубируют 1 час при 37°С, промывают 10 мл разделяющей среды и охлаждают до 4°С. Для разведения клеток, которое происходит при 4°С, на колонку емкостью 8 мл наносят 100—200х106 лимфоцитов крови человека в 10 мл среды для разделения со скоростью 0,5 мл/мин. После удаления всех клеток с колонки связавшиеся клетки элюируют 30 мл разделяющей среды, содержащей 10 мг/мл γ-глобулина человека.

Разделение Т- и В-лимфоцитов на сефарозе-С3

Отмытую сефарозу 4В 2 мл перемешивают с сывороткой человека, разведенной 1 :5 в течение 1 мин при 37°С. При этом происходит присоединение к сефарозе активированных молекул компонента комплемента СЗ. Свежеотмытой активированной сефарозой заполняют маленькую колонку (0,7x5см), нижний конец которой заполнен на высоту 2—3 мм слоем стеклянных гранул. Разделение клеток ведут при 4°С. Лимфоциты крови человека (20х106), суспензированные в 2 мл разделяющей среды, наносят на колонку со скоростью 0,5 мл/мин.

При элюции с первыми 15 мл элюата уходит большая часть несвязавшихся клеток, всего же колонку промывают приблизительно 30 мл среды MEM. Связавшиеся клетки элюируют сывороткой, содержащей АТ (антитело) к СЗ человека. На колонку наносят 1 мл этой сыворотки (титр 1 :512 по агглютинации), ждут 15 мин и элюируют клетки 30—40 мл среды.

Оценка вариантов метода

Для всех трех вышеописанных методов общим является то, что степень чистоты выделенных Т- или В-лимфоцитов достигает почти 100%, т. е. она выше или равна той, которую удается получить при помощи нагруженных стеклянных гранул или дегалана. Это существенное преимущество уравновешивает недостаток, обусловленный сложной процедурой разделения. Неспецифическое селективное связывание антителообразующих клеток с сефадексом, белковыми гранулами или сефарозой не может быть полностью исключено. Кроме этого, уменьшение потерь клеток, достигаемое ЭДТА, не селективно в отношении Т- или В-лимфоцитов. Методы разделения на колонках обладают еще и тем преимуществом, что их легче стандартизировать в отличие от методов разделения в чашках Петри, пробирках и пр., так как в последнем случае более или менее сильное встряхивание может стать причиной расхождения результатов. Кроме того, следует отдавать предпочтение методам, которые не вызывают стимуляции клеток. Вышеописанные методы в этом смысле пригодны для получения Т-лимфоцитов, так как элюируемые В-лимфоциты нельзя рассматривать как нестимулированные.

Возможность разделения Т- и В-лимфоцитов при помощи Fc-рецепторов комплексов антиген-антитело антиген-антитело до настоящего времени полностью не исследована. Сепарированные лимфоциты мыши или крысы характеризуются вполне определенными чертами, присущими Т- или В-клеткам в таких тестах, как цитотоксичность, флюоресценция, розеткообразование, антителообразование после переноса, РТПХ, продукция лимфоцитов и др.

Артефакты. Хотя неспецифическое связывание различных популяций лимфоцитов (в первую очередь В-лимфоциты) на вышеперечисленных материалах весьма незначительно, все же им нельзя совершенно пренебрегать. Так, например, сефадекс связывает антителообразующих клеток. Различные эффекты, наблюдаемые после разделения лимфоцитов на сывороточных гранулах, сефарозе или сефадексе, позволяют предположить, что при определенных условиях могут быть связаны также супрессорные клетки. В случае разделения при 37°С нельзя исключить появление так называемого «Shedding-феномена», если клетки предварительно были нагружены антителами или лигандами к рецепторам (собственные наблюдения авторов). Наконец, следует помнить о видовых различиях клеток. Количественное селективное связывание В-лимфоцитов мыши с комплексами антиген-антитело за счет Fc-рецепторов, по всей видимости, не применимо к Т-лимфоцитам человека, у которых имеются в относительно больших количествах Fc-рецепторы для IgG и IgM. Поскольку все же образование Fc-розеток Т-лимфоцитами человека требует особо длительного культивирования, без применения вышеупомянутых методов сепарации нельзя обойтись. Различия свойств лимфоцитов грызунов и человека указывают на то, что переносить результаты разделения клеток с одного вида на другой нужно осторожно. В настоящее время нельзя определить, насколько эффективны колонки с СЗ-сефарозой при разделении лимфоцитов других (кроме человека) биологических видов.

Copyright © 2011-2012