Главная

Равновесный диализ

Материалы и оборудование
Постановка опыта
Определение концентрации гаптена
Оценка метода

Равновесный диализ представляет собой классический метод определения параметров связывания низкомолекулярных лигандов с биополимерами, в том числе аффинности антител. Раствор антитела известной концентрации приводится в соприкосновение с раствором гаптена через полупроницаемую мембрану. Оба компонента растворены в одинаковом буфере для того, чтобы исключить разницу рН и ионной силы. Молекулы антител не приходят через мембрану, молекулы гаптена диффундируют через нее в раствор антител и частично связываются с ними. Состояние равновесия достигается, когда концентрация свободного гаптена становится одинаковой по обе стороны мембраны. Время диффузии зависит от проницаемости мембраны, природы гаптена и температуры. Измерив концентрацию свободного гаптена по обе стороны мембраны, можно определить количество гаптена, связанного с антителами. В процессе измерения следует учитывать мембранные эффекты, например, адсорбцию.

Поскольку молекулы антител несут определенный заряд, следует учитывать эффект Доннана в том случае, если гаптен тоже заряжен. Обычно для проведения диализа используют целлофановые пакеты или специально сконструированные диализные ячейки. Данному вопросу посвящен исчерпывающий обзор Eisen [Eisen H. N. Determination of antibody affinity for hapten by means of fluorescence quenching. — ibid. 115].

Материалы и оборудование

Сосуд для диализа,
раствор антитела,
раствор гаптена,
спектрофотометр или радиометр,
термостат.
В качестве растворителя чаще всего используют 0,01 М фосфатный буфер рН 7,4 или 0,1 М трис-НСl-буфер, рН 7,4. Величина рН и ионная сила могут варьировать в зависимости от целей эксперимента. Для уменьшения эффекта Доннана целесообразно использовать забуференный 0,15 М раствор NaCl. Выбор концентрации гаптена и антител зависит от ожидаемой величины константы равновесия.

Примерная концентрация антител для равновесного диализа при различных константах ассоциации

Константа ассоциации М-1 Концентрация антител г/л
1х105 3,6
1х106 0,36
1х107 0,36

Постановка опыта

В ячейку для диализа (в данном случае диализный мешок) вносят 2 мл раствора антител. Завязанный с обоих концов мешок помещают в подходящий сосуд, например, закрывающуюся стеклянную пробирку 10х75 мм. Затем в жидкость, против которой ведут диализ, вносят 2 мл раствора гаптена.

Схема диализного устройства

Схема диализного устройства

кружками обозначены антитела, точками — гаптен

Для эксперимента используют несколько пробирок с различными исходными концентрациями гаптена, это позволяет получить более точные значения константы ассоциации. Кроме того, необходимо проводить контрольный диализ, для чего диализные мешки, внутри которых находится только буфер, помещают в растворы гаптена с различными по меньшей мере двумя концентрациями. Это необходимо для определения момента наступления равновесия. Можно также определить количество гаптена, неспецифически связанного с материалом диализного мешка. Пробирки с образцами устанавливают в штатив и инкубируют в термостате при постоянном покачивании или вращении. Время наступления равновесия может колебаться от 4 при 30 °С до 20—40 ч при более низкой температуре.

Определение концентрации гаптена

Концентрацию окрашенных гаптенов можно определять с помощью спектрофотометрии. Для измерения концентраций гаптенов, меченных радиоактивными изотопами, применяют счетчики ионизирующего излучения. Сначала определяют в отсутствие антител количество неспецифически связанного гаптена. Это можно сделать, измерив количество гаптена в диализном мешке и в жидкости, омывающей мешок, после наступления равновесия. Количество неспецифически связанного гаптена равно разности между первоначально внесенным количеством гаптена и суммарным количеством гаптена по обе стороны диализной мембраны. В таблице приведены примеры подобных определений для пяти исходных концентраций. Условия опыта следующие: в диализной жидкости — 2 мл 14С-2,4-динитроанилина, внутри диализного мешка 2 мл буферного раствора (0,1 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М КCl). Продолжительность диализа составляет 5 часов при 30 °С в условиях медленного вращения; специфическая активность гаптена — 520 имп/нМоль. Измерения проводили с помощью жидкостного сцинтиляционного счетчика.

Определение количества неспецифически связанного гаптена

Исходная концентрация 10-6 М Равновесная концентрация при отсутствии неспецифического связывания 10-6 М Измеренная концентрация в равновесном состоянии Неспецифическое связывание
(% от концентрации свободного гаптена)
внутри снаружи
9,82 4,91 4,39 4,40 11,6
8,06 4,03 3,51 3,46 15,6
5,20 2,60 2,20 2,24 17,1
2,55 1,27 1,09 1,09 16,5
1,04 0,52 0,455 0,476 11,8

 

Данные, приведенные в таблице, представляют собой среднее значение данных, полученных в двух одинаковых измерительных стаканах. Учет неспецифически связанного гаптена облегчает расчет количества гаптена, связанного антителами.

Схематическое изображение равновесного диализа (после достижения состояния равновесия)

равновесный диализа после достижения состояния равновесия

светлыми кружками обозначены антитела, темными — антитела + гаптен, точками — гаптен

Определение количества гаптена, связанного антителами. Результаты измерений

Концентрация гаптена в диализной жидкости (вне мешка) перед началом опыта 10-6 М Концентрация свободного гаптена в диализной жидкости при равновесии 10-6 М Равновесная концентрация гаптена после внесения поправки 10-6 M Количество гаптена, связанного антителами, нМоль Число молей связанного гаптена на 1 Моль AT
9,82 3,34 4,41 4,28 1,60
8,06 2,52 3,65 4,52 1,69
5,20 1,41 2.39 3,92 1,47
2,55 0,48 1,20 2,88 1,08
1,03 0,083 0,51 1,71 0,64

Условия опыта: диализная жидкость вне мешка—2 мл 14С-2,4-диннтроаиилииа в различных концентрациях. В диализном мешке 2 мл раствора антител (240 мкг/мл, очищенных антител, специфичных к динитрофенильной детерминанте). Буфер: 0,01 М трис-HCl, рН 7,5, 0,1 М КС1; продолжительность диализа 5 ч при медленном вращении и температуре 30 °С.

Данные в колонке III таблице 4 откорригированы на 15% в соответствии с данными колонки II таблицы 1. В колонке IV таблицы 2 приводятся данные о количестве связанного антителами гаптена с учетом исходных концентраций и разностей значений в колонках II и III (молярное соотношение гаптена, связанного с AT, приведено в колонке V).

В таблице приведены данные измерений совместно с данными расчета. Поправка за неспецифическое связывание антигена была принята равной в среднем 15%.

Оценка метода

Методы определения гаптенов могут варьировать в зависимости от природы гаптена и ожидаемой константы ассоциации. При использовании окрашенных гаптенов в значениях констант ассоциации от 103 до 105 М-1 измерить концентрацию гаптена по оптимальной плотности. При исследовании систем с Ка выше 106 М-1 нужны более чувствительные методы, целесообразно использовать гаптены, меченные 14С. Радиоактивные гаптены весьма эффективны для определения Ка в области 106—107 Е-1. Для определения констант ассоциации в области 107—108 М-1 необходимы гаптены, меченные тритием. При еще более высоких константах ассоциации гаптен находится в основном в связанном состоянии и его прямое определение затруднено. Следует также учитывать, что при низких Ка необходимые для проведения измерений количества гаптена должны быть достаточно высокими, чтобы определить разницу между свободным и общим гаптеном внутри диализного мешка. Вследствие этого точное измерение концентрации АТ (антитело) затруднено. При проведении равновесного диализа не обязательно использовать высокоочищенные антитела.

Copyright © 2011-2012