Главная

Выделение трансфер-фактора. Методика

Для работы необходимы: гепарин без консервантов, декстран 250, инфуколл, апирогенная дистиллированная вода, 0,15М NaCl, сухой лед, этиловый спирт (денатурат), ДНКаза (панкреатическая), сульфат магния, диализные целлофановые мешки (например, Visking, США), шприцы, иглы, стеклянные стаканы на 25 мл, термостат, водяная баня, конические центрифужные стаканы на 20 мл, центрифуга, лабораторная посуда со шлифами, ампулы для лиофилизации, устройство для лиофилизации, миллипоровские фильтры (0,22 мкм) с держателем, сефадекс G-25, ФСБ с рН 7,4, азид натрия, хроматографические колонки, перистальтический насос, увикорд (фильтр 254 нм), автоматический коллектор фракций, рекордер.

Получение диализата экстракта лейкоцитов

Доноров с такими заболеваниями, как сифилис, малярия, гепатит и др., необходимо исключить. У доноров должна наблюдаться выраженная кожная реакция замедленного типа на соответствующий антиген. Препараты из лейкоцитов доноров с отрицательной кожной реакцией не переносят сенсибилизацию. Кроме того, для успешного переноса необходимо иметь достаточное количество лейкоцитов, которое зависит от используемого метода сенсибилизации. Для «локального» переноса достаточно 0,01 мл взвеси (8,5х10б лейкоцитов), для «системного» переноса — 0,1 мл (85х10б клеток). Кожную реакцию оценивают через 24, 48 и 72 ч. Важнейшим методом является «системный» перенос, при котором трансфер-фактор вводят внутрикожно, подкожно или внутримышечно в область плеча. Кожную пробу с антигеном проводят на ладонной поверхности предплечья с противоположной стороны. Кровь отбирают в стерильных условиях и разделяют на порции по 20 мл (на каждые 100 мл крови добавляют 500 ME гепарина).

Нет необходимости силиконизировать шприцы и посуду. Кровь разливают в стерильные пробирки (25X155 мм), добавляют 2 мл раствора декстрана 250 (60 г/л) в 0,15 М NaCl или раствор инфуколла. Пробирки закрывают, несколько раз встряхивают и инкубируют при 37 °С. Эритроциты осаждаются в течение 30—45 мии. Продолжительность седиментации не должна превышать 1 ч. Желтоватый или слегка красноватый слой надосадочной жидкости переносят при помощи пастеровской пипетки в конические центрифужные пробирки. Закрытые пробирки центрифугируют в течение 10 мин при 1500 g. Плазму «осторожно сливают. Осевшие лейкоциты образуют слой иад «садком эритроцитов. 0,1 мл осевших лейкоцитов соответствуют 85х10б клеток, этого количества достаточно для получения одной дозы препарата. Осадок состоит из 70% из лимфоцитов. Самая нижняя часть конуса пробирки заполнена эритроцитами. На слой лейкоцитов наслаивают 0,1 мл стерильного апирогенного 0,15 М раствора NaCl. Кончик пастеровской пипетки осторожно проводят сквозь слой раствора соли и осторожно отсасывают лейкоциты в виде суспензии в изотоническом растворе NaCl. Можно объединять полученные суспензии лейкоцитов. Для получения ДЭЛ необходимо полное разрушение лейкоцитов. Оно достигается 10-кратным замораживанием и оттаиванием суспензии. Пробирки с суспензией клеток замораживают смесью сухого льда с этанолом, а размораживают на водяной бане при 37 °С. Процесс повторяют до тех пор, пока жидкость не станет вязкой. При полном разрушении лейкоцитов высвобождается ДНК, делающая раствор чрезвычайно вязким и затрудняющая его дальнейшую обработку. Для деполимеризации ДНК в раствор вносят несколько кристаллов ДНКазы и небольшое количество ионов Mg2+. Гидролиз протекает в течение 30 мин при 37 °С.

Если ДНКазу, которая отличается чрезвычайной стабильностью, добавлять прямо к суспензии лейкоцитов, то деполимеризация ДНК происходит в процессе замораживания и оттаивания и не требует дополнительной инкубации. Для удаления высокомолекулярных компонентов проводят диализ. Обработанный ДНКазой экстракт лейкоцитов осторожно переносят в завязанный с одного конца диализный мешок, стараясь не испачкать экстрактом наружный слой мешка, после чего его завязывают, ополаскивают стерильным апирогенным изотоническим раствором NaCl и переносят мешок в стерильный сосуд с дистиллированной водой. На 0,1 мл экстракта используют 5 мл дистиллированной воды. Диализ проходит в течение 24 ч при 4°С. По окончании диализа диализат переносят в стерильный сосуд, замораживают смесью сухого льда со спиртом и лиофилизируют. В таком виде продукт сохраняет активность в течение года при 4°С. Перед употреблением лиофилизированный препарат растворяют в стерильной апирогенной воде по 20 мл да ампулу (соответствует 0,1 мл экстракта). Раствор фильтруют через миллипоровский фильтр (диаметр пор 0,22 мкм) в стерильных условиях. Этап стерилизирующей фильтрации является безусловно необходимым для очистки препарата от возможного бактериального заражения в ходе диализа. Отдельные стадии процесса представлены на рисунке.

Этапы получения трансфер-фактора, модифицированный метод

Этапы получения трансфер-фактора, модифицированный метод

1 — кровь и декстран; 2 — седиментация эритроцитов; 3 — центрифугирование надосадочной фракции;
4 — наслаивание иа осадок 0,15 М NaCl; 5— 10-кратиое замораживание и оттаивание с прибавлением ДНКазы;
6 — диализ; 7 — лиофилизация; 8 — стерилизующая фильтрация; 9 — разлив по ампулам; 10 — инъекция

Выделение трансфер-фактора (ТФ)

ДЭЛ, получение которого описано выше, растворяют в ФСБ с рН 7,4 в соотношении 1:20, при необходимости центрифугируют 20 мин при 10 000 и проводят стерилизацию фильтрацией. Выделение ТФ осуществляют на колонках размером 20X530 или 50X1000 мм. Колонки с сефадексом G-25, законсервированные 0,2% азидом натрия, перед разделением промывают тремя объемами разведенного в соотношении 1:20 PO4NaCl-буфера (8,5 г/л NaCl, 0,01 М фосфатный буфер, ipH 7,4). Раствор ДЭЛ в стерильных условиях наносят на колонку. Проводят восходящую хроматографию в вышеприведенном стерильном буфере. Скорость фильтрации может достигать 90 мл/час. Фракции собирают, лиофилизируют и при необходимости разводят апирогенной дистиллированной водой до изотонического состояния, затем проводят стерилизующую фильтрацию. На рисунке ниже представлен характерный профиль гель-фильтрации ДЭЛ.

Профиль элюции ДЭЛ при разделении на сефадексе G-25 (fine)

Профиль элюции ДЭЛ при разделении на сефадексе G-25 (fine)

Условия эксперимента: 150 мг ДЭЛ; колонка 50х600 мм; прочие детали описаны в тексте

Биологическую активность фракций оценивают по так называемому «Recovery assay»1. Активность ТФ представлена в виде столбиков черного цвета. Многие авторы подтверждают наличие биологической активности обеих фракций. Для терапевтических целей объединяют обе активные фракции, отбрасывая неактивные, и обозначают смесь активных фракций как ТФ. Вопрос об идентичности ТФ в обоих фракциях остается открытым.

1 Лимфоциты человека обладают способностью образовывать розетки с ЭБ. С трипсинизированными ЭБ розетки не образуются. Обработка лимфоцитов трансфер-фактором «восстанавливает» их способность к розектообразованию с трипсинизированными ЭБ. Это явление называется Recovery assay.

Copyright © 2011-2012