Главная

Пенициллоил-полилизин

Материалы и оборудование. Для работы необходимы 100 мг полилизина HCl (20 аминокислотных остатков на молекулу), 2,4 г бензилпенициллина калиевой соли, 1 М раствор карбоната натрия с рН 10, 4, 5 М NaOH, 0,002 М фосфатный буфер с рН 8,0, диализный мешок.

Методика

Растворяют 100 мг полилизина-HCl в 0,4 мл воды и нейтрализуют 5 М NaOH. Затем добавляют 1 мл 1 М карбоната (рН 10,4) и 1,2 г бензилпенициллина. Доводят рН до 9,6 5 М NaOH и, если необходимо, добавляют воду для полного растворения пенициллина. По 600 мг бензилпенициллина добавляют через 16 и 24 ч. После каждого добавления рН подводят до 11,0. Через 6 ч после последнего внесения пенициллина проводят диализ против 0,002 М фосфатного буфера с рН 8,0.

Обсуждение

Хотя реакция при рН 9,6 протекает медленно, повышать рН не имеет смысла, так как растворимость полилизина снижается. При хотя бы частичном замещении полилизин не выладает в осадок и при более высоких значениях рН. Степень замещения определяют, оценивая содержание белка по Кьельдалю (необходима поправка, поскольку гаптен также содержит азот) и определяя количество пенициллоильных групп в реакции с парахлормеркурибензоатом (ПХМБ). Продукт реакции характеризуется сильным поглощением на длине волны 285 нм. Молярный коэффициент экстинкции составляет 23 800. Реакцию проводят в 0,05 М карбонате с рН 9,2 при 4—50-кратном избытке ПХМБ. Следует учитывать разведение, вызываемое добавлением ПХМБ, а также экстинкцию, обусловленную непрореагировавшим ПХМБ.

Copyright © 2011-2012