Главная

Выделение иммуноглобулина M (IgM)

Принцип метода

Иммуноглобулин М присутствует в сыворотке в меньших количествах, чем IgA и IgG. Поэтому часто в качестве исходного материала используют сыворотку больных макроглобулинемией Вальденстрема для получения IgM. Основные методы выделения IgM — гель-фильтрация и зональный электрофорез. Часто используют осаждение фракции эуглобулинов. Липопротеиды удаляют сульфатом декстрана и СаСl2.

Получение IgM человека

Материалы и оборудование. Для работы нужно иметь: СаС12, декстрансульфат, полиэтиленгликоля 6000, сефадекс G-200 или сефарозу 4 В, сефарозу 6 В, биогель А-15, 0,05 М фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,5 М NaCl и 2% бутанола, 0,1 М вероналовый буфер с рН 8,6, поливинилхлорид, прибор для зонального электрофореза, колонки для гель-фильтрации длиной 100 см.

Методика. Выделение IgM проводят в четыре этапа.

1. Удаляют липопротеиды низкой плотности осаждением декстрансульфатом (относительная молекулярная масса 560 000, 5 г/л) и 0,09 М СаС12.

2. Осаждение макроглобулинов полиэтиленгликоля (относительная молекулярная масса 6000), 75 г/л.

3. Гель-фильтрация (после растворения) макроглобулинов на сефадексе G-200, сефарозе 4 В или биогеле А-15 в фосфатном буфере 0,05 М с рН 7,2 (см. выше), содержащем 0,5 М NaCl и 2% бутанола.

4. Разделение IgM и α-макроглобулина при помощи зонального электрофореза на поливинилхлориде в 0,1 М вероналовом буфере с рН 8,6.

Обсуждение Для разделения белков полиэтиленгликоля (6000) оказался особенно удобным, поскольку он не приводит к их денатурации (см. таблицу).

Фракционирование сыворотки человека Полиэгиленгликолем

Фракционирование сыворотки человека Полиэгиленгликолем

Если гель-фильтрация на биогеле А-15 протекает на очень длинных колонках (3 м) или проводится циклическая рефильтрация, то можно наблюдать частичное разделение IgM и α2-макроглобулина. К зональному электрофорезу в этих условиях можно не прибегать, поскольку первая часть пика свободна от α-2-макроглобулина.

Иммуноглобулин М из нормальной сыворотки также получают в 2 этапа при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-200 н электрофореза в колонках. Препарат все же содержит следы α2-липопротеина. Точно так же IgM можно выделять методом гель-фильтрации на сефакриле S-300 н аффинной хроматографией на протеин-А-сефарозе 4 В. На этапе гель-хроматографии удаляются IgA и IgG. Элюцию с протеин-А-сефарозы проводят 0,1 М цитратным буфером с рН 2,7, собранные фракции немедленно нейтрализуют 2,5 М трис-HCl-буфером с рН 8,5. Часто для выделения IgM из нормальной сыворотки больных микроглобулинемией Вальденстрема сначала осаждают фракцию эуглобулинов. Для этого сыворотку либо диализуют против дистиллированной воды, 0,0067 М фосфатного буфера с рН 5,8 или 0,002 М фосфатного буфера с рН 6,0 либо проводят 10-кратное разведение сыворотки дистиллированной водой. Из сыворотки больных макроглобулинемией достаточно чистый IgM можно получить одной лишь гель-фильтрацией на сефадексе G-200. IgM-парапротеины можно выделить относительно простым путем независимо от электрофоретической мобильности следующим образом: 100 мл плазмы дефибринируют добавлением 100 ЕД тромбина в 1 М СаСl2 (1 мл). После 30-минутной инкубации при 37 °С при постоянном помешивании фибрин осаждают центрифугированием в течение 30 мин при 10 000 (4°С). Затем проводят фильтрацию на ультрагеле АсА 34 в 0,1 М трис-HCl-буфере с рН 8,0, содержащем 0,15 М NaCl и 0,02% азида натрия (длина колонки 1 м). Первый пик содержит IgM. Фракции, содержащие IgM, диализируют против стартового буфера (0,05 М Na2НР04/лимонная кислота с рН 6,8). Элюцию проводят линейным градиентом стартового буфера (300 мл) и 0,1 М буфера Na2НР04/лимонная кислота с рН 5,0 (300 мл). Первый пик, появляющийся при градиентной элюции, — IgM. Его диализуют против 0,1 М трис-HCl-буфера с рН 8,0 и концентрируют ультрафильтрацией до 10 мг/мл.

Выделение IgM из сыворотки кролика

Кроличий IgM выделяют тем же самым методом, что и IgM человека:

Сыворотка (580 мл)
Осаждеиие (NH4)2SO« (0,35 насыщения) 3 раза

Преципитат
Растворение в 144 мл 0,15 М NaCl, замораживание (—30°С), размораживание, фильтрация, центрифугирование 6,5 г при 50 000 об/мин

Осадок
Растворение в 72 мл 0,15 М NaCl, наслаивание на равный объем 2 М 1 СаСl2, центрифугирование 11 г при 50 000 об/мин

Осадок
Раствореиие в 15 мл 0,15 М NaCl, добавление 0,6 мл 10% раствора декстрансульфата (относительная молекулярная масса 2 000 000) н 1,5 мл 1 М СаС12, центрифугирование 15 мин. Диализ надосадочной фракции в течение 12 ч против 0,15 М NaCl, центрифугирование

Надосадочная фракция
Гель-фильтрация на сефадексе G-200

Пик IgM
Концентрирование до 5 мл, проведение электрофореза на колонках с сефадексом G-100 (буфер: 3 г трис и 14,4 г глицина на 1 л)

30 мг IgM

Благодаря ультрацентрифугированию уменьшается содержание IgM и частично удаляются липопротеиды. Замораживание и оттаивание с последующей фильтрацией также приводит к частичному удалению липопротеидов. Полного их удаления достигают с помощью декстрансульфата и СаСl2. Предварительное осаждение эуглобулинов не имеет особого смысла, поскольку IgM кролика почти не содержится в осадке эуглобулинов.

Иммуноглобулин М из сыворотки кролика можно получить комбинацией методов, указанных ниже.

1. Двукратное высаливание сульфатом натрия (180 г/л)

2. Ионообменная хроматография

а) Ступенчатое фракционирование на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,0175 М фосфатном буфере с рН 6,9. Элюирование проводят тем же буфером, содержащим 0,1325 М NaCl и 0,1525 М NaCl.

б) Фракцию, элюированную 0,1525 М NaCl, наносят на ДЭАЭ-целлюлозу (4 мг белка на 1 мл ионообменника) в 0,05 М трис-НСl-буфере с рН 8,6. Собирают фракции, полученные с использованием стартового буфера и того же буфера, но содержащего 0,1 М NaCl. Их диализуют против 0,001 М боратного буфера с рН 8,0, содержащего 0,32 М NaCl, и наносят на колонку биогеля Р-200 (2,5х100 см).

в) Двукратная хроматография на биогеле Р-200. Восходящая часть первого пика содержит иммуноэлектрофоретически чистый IgM.

IgM кролика можно также получить методом иммуноадсорбции с использованием антисыворотки к μ-цепи человека. Инфекции, вызванные трипаносомами, повышают уровень IgM в сыворотке у кроликов, IgM может быть выделен из такой сыворотки гель-фильтрацией на сефадексе G-200 (1-й пик). Дальнейшую очистку проводят центрифугированием после хранения при 4°С в течение ночи и зональным электрофорезом надосадочной фракции в блоке агарозы в вероналовом буфере с рН 8,6.

Выделение IgM из сыворотки других животных

Иммуноглобулин М крупного рогатого скота выделяют из фракции эуглобулинов сыворотки или молозива, которые диализуют против 0,005 М фосфатного буфера с рН 6,0. Дальнейшую очистку проводят при помощи ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и последующей гель-фильтрации. Фракцию эуглобулинов диализуют против 0,06 М фосфатного буфера с рН 7,0. Элюцию IgM с ДЭАЭ-целлюлозы проводят ступенчатым градиентом: 0,06 М фосфатный буфер с рН 7,0, 0,10 М фосфатный буфер с рН 6,0 и 0,20 М фосфатный буфер с рН 6,0. IgM десорбируется с 0,20 М буфером. Доочистку проводят двукратной гель-фильтрацией на сефадексе G-200. Аналогичный способ очистки применяют для получения IgM из сыворотки лошади. IgM из сыворотки иммунизированных мышей получают хроматографией на сефадексе G-25, G-200 и ультрацентрифугированием. Сыворотку в количестве 1—3 мл наносят на колонку (2,5х100 см) с сефадексом G-25, уравновешенным дистиллированной водой или 0,0001 М фосфатным буфером с рН 7,0. Элюируют 0,01 М фосфатным буфером с рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl. При фильтрации выявляются два пика, первый из которых содержит большую часть сывороточных белков. Распределение иммуноглобулинов указано в таблице.

Распределение иммуноглобулинов при гель-фильтрации на сефадексе G-25

Распределение иммуноглобулинов при гель-фильтрации на сефадексе G-25

Для дальнейшей очистки собирают материал 2-го пика и проводят гель-фильтрацию на сефадексе G-200 в 0,1 М трис-HCl-буфере с рН 8,2, содержащем 1 М NaCl. Первая часть 1-го пика состоит из почти чистого IgM, лишь иногда загрязненного небольшой примесью α2-липопротеидов. Дополнительное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы позволяет получить чистый IgM. Выход составляет 15—20%. IgM из сыворотки крыс можно выделить методом иммуноадсорбции при помощи антисыворотки к μ-цепям человека. IgM из молозива свиней, после удаления жира, казеина и липопротеидов, получают ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе при помощи градиента трис-HCl-буфера с рН 7,4 0,002—0,3 М. IgM элюируется совместно с S-IgA и IgG 1 в средней части градиента. Чистый IgM получают после гель-фильтрации на сефарозе 6 В. Из сыворотки свиньи IgM можно выделить осаждением борной кислотой (диализ против раствора борной кислоты, 7,5 г/л) с последующей гель-фильтрацией через сефадекс G-200 (длина колонки 150 см).

Иммуноглобулин М из сыворотки кур осаждают сульфатом аммония (насыщение 0,3), проводят ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюирование проводят ступенчатым градиентом: 0,06 М NaCl в 0,01 М трис-HCl-буфере с рН 8,0 и 0,12 М NaCl в том же буфере. Собирают фракцию, элюируемую вторым буфером, и проводят повторную гель-фильтрации на сефадексе G-200. Первая половина 1-го пика содержит IgM.

Copyright © 2011-2012