Главная

Выявление хемотаксических факторов. Оценка метода

Метод, предложенный Boyden, и его различные модификации в настоящее время представляются методом выбора для изучения хемотаксиса лейкоцитов. Этот метод позволяет получить ценные данные относительно механизмов хемотаксиса и специфического и неспецифического воспаления. В клинике его используют для оценки функциональной активности лейкоцитов и для выявления клеточного иммунитета. Решающее значение для воспроизводимости результатов имеет выбор фильтров. Поэтому перед использованием в эксперименте мембраны подлежат испытанию со стандартным хемотаксический агентом (например, фильтрат культуры бактерий) для выяснения, возможна ли миграция через данные фильтры, не слишком ли она велика в контроле. Для уменьшения разброса данных следует пользоваться одной и той же партией проверенных фильтров. Кроме того, для получения сравнимых данных следует пользоваться суспензиями клеток одинаковой концентрации. Разброс данных может составлять 10—20%.

К числу недостатков метода можно отнести сложности в определении отдельных типов клеток. Хотя известны сообщения об успешной идентификации мигрирующих клеток, большинство авторов скептически относятся к такой возможности. Этот недостаток особенно заметен, когда речь идет об исследовании макрофагов. Обогащенные макрофагами экссудаты содержат также нейтрофилы, которые особенно сильно реагируют на хемотаксические стимулы. Поскольку хемотаксическая чувствительность нейтрофилов намного выше, чем у макрофагов, даже небольшая примесь нейтрофилов может существенно искажать результаты исследования. При исследовании хемотаксиса нейтрофилов проблему определения типов клеток можно обойти использованием мембран с таким размером пор (0,65 мкм), который не допускает миграции крупных клеток. Но в этом случае приходится подсчитывать клетки во всех слоях фильтра.

Поликарбонатные фильтры (нуклеопор) отличаются от миллипоровских фильтров однотипной цилиндрической формой пор и меньшей толщиной мембраны (12 мкм по сравнению с 150 мкм). Их преимущество состоит в том, что клетки, проходя через мембрану, менее деформируются и легче поддаются морфологической идентификации. Время инкубации тоже можно сократить. Чувствительность метода можно повысить, если определять расстояние клеточного фронта от поверхности мембраны при помощи микрометра микроскопа. Время инкубации при этом сокращается до 1 ч для нейтрофилов и до 3 ч для мононуклеотидов. Фронт миграции определяют по двум ведущим клеткам, которые отчетливо выделяются на плоскости. Фильтр делают прозрачным при помощи ксилола.

Этот метод превосходит другие известные методы с использованием фильтров ввиду его большей чувствительности; относительно небольшие изменения миграции, порядка 10 мкм, являются статистически значимыми. Разброс результатов и воспроизводимость также лучше. Варьируя концентрации исследуемых веществ, можно уточнить данные о миграции в зависимости от градиента и тем самым точнее дифференцировать направленную миграцию от ненаправленной. Этот метод часто подвергают критике за то, что он применим только к наиболее быстро мигрирующим клеткам.

Использованием меченных радиоактивным хромом лейкоцитов и автоматическим подсчетом клеток можно существенно снизить субъективные ошибки. Еще один упрощенный метод изучения хемотаксиса основан на использовании бумажных фильтров, смоченных раствором хемотаксического агента. Мембрану накладывают на такой фильтр, оценивают толщину слоя клеток, проникших в мембрану. Лейкотаксис можно определять, используя в качестве среды агарозу. Но сравнению с мембранными методами возникает дополнительная возможность одновременного определения хемотаксической и спонтанной миграции. Снижаются необходимое для проведения анализа количество клеток и затраты времени. Остается только ждать, вытеснит ли агарозный метод мембранные.

Copyright © 2011-2012