Главная

Реакция торможения миграции лейкоцитов. Методика

Материалы и оборудование

Для работы необходимы среда для культивирования (Игла-МЕМ с рН 7,4) со 100 ME пенициллина/мл и 100 мкг стрептомицина/мл, инактивированная сыворотка (морской свинки, человеческая АВ, телячья), инфуколл 6%, вазиленовое масло (стерильное), гепарин без консервантов (Gedeon Richter, Венгрия), силиконовая смазка NP 12 (хим. завод Niinchrittz, ГДР), пластилин, стерильное рабочее место (например, ламинарный бокс), камера для миграции (например, из пиакрила 90х90х15 мм с 4х4 лунками диаметром 17 мм или планшеты Costar с 24 лунками, США), гематокритные капилляры (1х50 мм) центрифуга, термостат, микроскоп, камера для счета клеток, аналитические весы.

Получение надосадочной фракции лимфоцитов

Препарат лимфоцитов получают из гепаринизированной крови в градиенте плотности (см. раздел "Разделение клеток иммунной системы"). Дважды отмытые клетки в концентрации 1х106/мл в среде Игла-MEM с антибиотиками инкубируют с соответствующим антигеном 20 часов при 37 °С. Бесклеточную надосадочную фракцию получают центрифугированием (10 мин, 1500g).

Индикаторные клетки

Подготовка макрофагов.За три дня до выделения макрофагов морским свинкам вводят внутрибрюшиино по 20 мл вазелинового масла. Полученный экссудат центрифугируют 20 мин при 150g, слой масла отбрасывают, осадок клеток ресуспендируют в чистых центрифужных пробирках и дважды отмывают средой Игла-МЕМ (10 мин, 150g). Готовят суспензию макрофагов из расчета 1— 2х108/мл в среде Игла-МЕМ с 10% сыворотки. Подготовка лейкоцитов. Гепаринизированную кровь (30 ЕД гепарина на 1 мл) в соотношении 4+1 смешивают с 6% инфуколлом и оставляют на 1 час при 37 °С. Содержащую лейкоциты надосадочную фракцию трижды отмывают в среде Игла (10 мин, 150g), готовят суспензию лейкоцитов 1—2х108 клеток/мл в среде Игла с добавкой 10% сыворотки.

Постановка реакции

Капилляры погружают в суспензию индикаторных клеток, заполнение происходит под действием капиллярных сил. Верхний конец заполненного капилляра затыкают пальцем, вынимают капилляр из клеточной суспензии и втыкают его нижним концом в пластилин для закупоривания. Подготовленные таким образом 20—30 капилляров ставят вертикально в центрифужный стакан и центрифугируют 10 мин при 30—40g. Затем на уровне границы раздела клетки/надосадочная фракция капилляры надпиливают и обламывают. Закрытый конец капилляра обмакивают в силиконовую смазку и фиксируют капилляр на дне лунки (см. рисунок). Вся работа должна проводиться в стерильных условиях. Заполнение камер соответствующей надосадочной фракцией культуры лимфоцитов производится немедленно после фиксации капилляра. При использовании планшетов Costar в каждую лунку вносят 1 мл исследуемой надосадочной фракции. Концентрацию антигенов подбирают в предварительном опыте, обычно ставят 4 параллельные пробы. Контроль: индикаторные клетки со средой (положительный контроль); индикаторные клетки с надосадочной фракцией, содержащей MIF (непрямой метод) или, соответственно 5 мкг/мл КонА в РТМ лейкоцитов (прямой метод). Камеры для миграции инкубируют 20 часов при 37°С, затем определяют величину площадки миграции, вырезают ее и взвешивают. Индекс миграции получают из соотношения средних значений миграции в опыте и контроле (пример см. рисунок).

Выборочные результаты по реакции торможения миграции

Выборочные результаты по реакции торможения миграции

А — контрольные клетки; Б — 5 мкг/мл КоиА; В — 20 мкг/мл надосадочной фракции с КонА-сефарозой;
Г — надосадочная фракция (В), обработанная 100 мкл антн-КонА/мл; Д — 200 мкл кандидина;
Е — надосадочная фракция лимфоцитов человека, стимулированных 5 мкг/мл КонА;
Ж — как Е, но концентрация в 4 раза выше; 3 — как Ж, ио концентрация в 4 раза выше;
И — как 3, но концентрация в 6 раз выше.

Оценка метода

РТМ представляет собой классический метод количественной оценки клеточной сенсибилизации. Разброс результатов составляет ±10%, поэтому индексы миграции, лежащие за предела ми 0,80—1,20, обычно считают положительными. Модификации приведены в разделе 3.10 и обзоре. Механизм торможения миграции лимфокинами также описан.

Copyright © 2011-2012