Главная

Цитотоксические клетки после аллогенной стимуляции

Эффекторные клетки из смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ). Селезенки респондеров и стимуляторов мягко разрушают в гомогенизаторе Поттера в ФСБ, дают клеткам осесть в течение 8 мин, надосадочные фракции отбрасывают, дважды отмывают клетки. Клетки стимулятора 100х106, суспендированные в 10 мл ФСБ, инкубируют в течение 20 мин при 37 °С с 250 мкл митомицина С (Ferak, Западный Берлин); трижды отмывают клетки. В культуральных флаконах на 200 мл смешивают в 15 мл среды II 20х106 клеток респондера и 10х106 клеток стимулятора. Культивируют 5 дней при 37°С во влагонасыщенной атмосфере с 10% СО2. Клетки отделяют от стенок палочкой с резиновым наконечником, дважды отмывают и готовят 3 суспензии с концентрацией 10х106, 5х106 и 2,5х106 клеток/мл соответственно.

В качестве контроля используют сингенные стимулирующие клетки, обработанные митомицином С.

Обработанные митогенами клетки в качестве клеток-мишеней. Селезенку стимулятора обрабатывают как было описано выше. Стимулирование проводят 100 мкг Кон (Pharmacia, Швеция), затем 20х106 спленоцитов в 10 мл среды II инкубируют в 100 мл сосудах в присутствии КонА. Клетки отделяют палочкой с резиновым наконечником, суспензию клеток подслаивают раствором фиколл/визотраст с плотностью 1,077. После 15-минусного центрифугирования при 200 g отбирают клетки, скопившиеся над разделяющей фазой, и отмывают их. Для маркирования 10х106 клеток используют 10 мБк 51 [Сг]. Готовят суспензию клеток 1х106/мл.

Высвобождение 51 Сг. Цитотоксичность оценивают в микропланшетах с лунками V-образной формы. Конечный объем составляет 100 мкл. Кривую титрования строят для 3 различных соотношений эффекторы : мишени.

Инкубацию ведут 2 ч при 37 °С в вышеуказанных условиях. Для статистической достоверности достаточно использования двойных проб. Планшеты центрифугируют, отбирают по 50 мкл надосадочной фракции и измеряют радиоактивность гамма-счетчиком. Цитотоксичность определяют по уравнению 6 (см. раздел  «Расчет»). На модели, использующей лимфоциты мышей С57В1 анти-Ваlb/с, при соотношении э : м, равном 10 : 1, цитотоксичность составляет 65%. По сравнению с результатами, которые наблюдаются при использовании эффекторных клеток, полученных иммунизацией in vivo, индекс цитотоксичности примерно в 3 раза выше. Это явление обусловлено СКЛ и включением в процесс Т-клеток, ранее не участвовавших в реакции.

Оценка метода, модификации. Стимуляция эффекторных клеток in vitro в СКЛ весьма распространена, часто в дополнение к СКЛ используют также иммунизацию in vivo. Миниатюризация метода особенно удобна при работе с эффекторными клетками человека. Известны модификации, в которых конечный объем пробы составляет всего 8 мкл. Расчет цитотоксичности ведется не по отношению к спонтанному высвобождению метки (клетки-мишени+ среда), а по отношению к лимфоцитам обработанных сингенных животных. Это обусловлено тем, что лимфоциты контрольных животных также вызывают лизис клеток-мишеней. Этот лизис может обусловливать дополнительные 15% высвобождения метки по сравнению со спонтанным высвобождением. Соотношения э : м, равные 10: 1, 5:1, 2,5: 1, были отобраны в качестве оптимальных из исследованных соотношений 0,5:1—100:1. Они позволяют воспроизводить подъем кривой, а также сравнивать Различные экспериментальные модели у животных.

Copyright © 2011-2012