Главная

Комплементзависимая цитотоксичность. Постановка опыта

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: тестерные сыворотки «анти-HLA»; полиспецифическая сыворотка «анти-HLA» (положительный контроль); АВ-сыворотка без антител (отрицательный контроль); АВ-сыворотка, инактивированная нагреванием (добавка к среде); комплемент кролика; фосфатный буфер XVI (1,15 г двузамещенного фосфата натрия, 0,200 г однозамещенного фосфата калия, 0,200 г хлорида калия, 8,00 г хлорида натрия растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, рН 7,2); раствор Хенкса (Государственный институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин); среда для сепарации (5,6 г фиколла) (Pharmacia, Швеция), 94,4 мл дистиллированной воды, 20,0 мл Visotrast 370 (Fahlberg List, Магдебург) с плотностью 1,076 пли 6,0 г декстрана (сывороточное предприятие, Бернбург), 16,0 мл Visotrast, дистиллированная вода до 100 мл (плотность 1,076 г/л); водный раствор натриевой соли эозина 50 г/л (Laborchemie, Апольда); азид натрия 0,1%; гепарин (Гедеон Рихтер, Будапешт); полужидкий парафин; безкислотный формалин с рН 7,2 (содержание формальдегида около 300 г/л); культуральные среды, RPMI или Игла (например, Институт иммунологических препаратов, Берлин); меченная ФИТЦ антисыворотка к IgG человека (Behring Werke, Марбург); этидий-бромид "(Ferak, Западный Берлин); ЭДТА 60 г/л; найлоновая вата, найлоновые волокна (Fenwal Lab., США); соломка для питья (Sweethart Straw, США); глазная вата (Vliestextilien, ГДР); микрокамеры для постановки реакции (так называемые камеры Терасаки, Polypast, Хальберштадт или Microtest Tissue Culture Plats № 3034 США); микрошприцы (Hamilton № 705 с дозирующим устройством № РВ-600); фазово-контрастный микроскоп, инвертированный микроскоп для люминесцентной -микроскопии, камера для тестирования HLA-DR (Hamax-Kammern, Норвегия).

Получение лимфоцитов. Суспензию лимфоцитов получают из свежей гепаринизированной или дефибринпроваиной крови при помощи флотации. Для этого 2 мл генаринизированной венозной крови (5 ME гепарина) смешивают с 2 мл фосфатного буфера XVI или с солевым раствором Хэнкса. Наслаивают эту смесь в центрифужную пробирку, содержащую 2 мл среды для сепарации. После центрифугирования в течение 10 мин при 2000 g или 30 мин при 300 g между плазмой и средой для сепарации образуется резко очерченный слой лимфоцитов (цветная вкладка II). Суспензию лимфоцитов отсасывают пипеткой и центрифугируют 10 мин при 100 g (дифференциальное центрифугирование для удаления тромбоцитов), надосадочную фракцию отбрасывают, осажденные лимфоциты отмывают фосфатным буфером XVI и снова осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 g. Дефибринирование свежеотобранной крови позволяет удалить примесь тромбоцитов перед флотацией. Дефибринирование проводят путем встряхивания 10—20 мл венозной крови с 20 стеклянными бусинами диаметром 4—6 мм в колбе Эрленмейера в течение 10—15 мин. Не позднее чем через 2 часа дефибринированная кровь должна быть использована для дальнейшей работы. Готовая суспензия лимфоцитов может храниться до 24 часов при 4°С в культуральной срсдс. Длительное хранение суспензии возможно в жидком азоте (—196 "С) после добавления криоконсерванта диметнлсульфоксида (ДМСО).

Микромодификация реакции лимфоцитолиза. Свежеполученную суспензию лимфоцитов разводят до концентрации 3*109 клеток/л. В ячейки для реакции камеры Терасаки осторожно вносят вазелиновое масло (2—3 мл в камеру) с тем, чтобы последующие реакции проходили в отсутствие воздуха. При частом употреблении камеры можно отказаться от использования вазелинового масла, если под крышку положить полоску фильтровальной бумаги, смоченной водой для создания водонасыщенной атмосферы.

В каждую лунку добавляют 1 мкл исследуемой сыворотки и 1 мкл суспензии лимфоцитов. После 30 минут инкубации при 22 °С добавляют 5 мкл комплемента морской свинки и инкубируют еще 60 минут при 22 °С.

Для окрашивания мертвых клеток в каждую лунку вносят по 1—3 мкл раствора эозина. При использовании парафиновых камер цветную реакцию фиксируют через 2 минут 8—10 мкл раствора формальдегида. Для седиментации клеток камеру оставляют на 60 минут при 22 °С. После фиксации оценку результатов можно проводить через 24 или 48 часов. При использовании камер без вазелинового масла реакцию останавливают осторожным приливанием фосфатного буфера XVI. После этого смесь можно немедленно анализировать под микроскопом. После приливания буфера считывание результатов возможно не более чем через 2—3 часа при выдерживании камеры при 4°С.

Оценка результатов. Микроскопию проводят при 100—200-кратном увеличении, по возможности в условиях фазового контраста. Количество неживых клеток учитывают по ни выраженности в крестах или словесно.

Степень выраженности (кресты)

Неживые клетки (%) 

0—10 —отрицательная
11—20 —1+
21—50 —2+
51—75 —3+
76—100 — 4+

Степень выраженности (словесное выражение)

Неживые клетки (%) 

0—10 —отрицательная
11—20 — отрицательная (?)
21—40 —положительная (?)
41—80 —положительная
81—100 —резко положительная

Контроль: ставят отрицательный контроль с АВ-сывороткой и положительный контроль с высокореактивной полиспецифической HLA-сывороткой.

Комплемент

В качестве источника комплемента для ЛЦТ используют пуловую сыворотку морских свинок (не менее чем от 6 животных). Поскольку активность комплемента у различных животных может сильно вырьировать, желательно, чтобы общий пул сыворотки составлял 3—5 л (хранение осуществляют в замороженном состоянии небольшими порциями).

При оценке новых серий комплемента необходимо использовать одинаковые сыворотки и планерные лимфоциты для создания определенных, постоянных условий эксперимента. Хороший комплемент дает реакцию 4+ в разведении 1+2. Помимо титра, определяют оптимальное время реакции, для чего инкубацию проводят в предел ах, 1—3 часов и определяют минимальное время наиболее выраженной реакции. Комплемент хранят при температуре —196 °С или —80 °С, транспортируют в лиофилизированном состоянии при температуре 2°—8°С. Повторное замораживание и оттаивание комплемента недопустимо.

Типирующие сыворотки

Анти-НLА-сыворотки получают от иммунизированных доноров. Иммунизация может быть вызвана беременностью (у 10—20% беременных вырабатываются антитела к HLA-антигенам плода отцовского происхождения), переливанием крови или трансплантацией органов. Направленная иммунизация доноров пересадкой кожи, переливанием крови или лейкоцитарной массы приводит к появлению высокоактивных антител к HLA-антигенам.

Ксено-антисыворотки (кроличьи, шимпанзе) не используются в рутинной лабораторной практике, поскольку их получение требует наличия очищенных антигенов или адсорбции получаемых сывороток. Ксеногенные моноклональные антитела до настоящего времени используются только в немногих лабораториях, несмотря на их явные преимущества. Моноклональные антитела следует в первую очередь применять для стандартизации или исследования антигенных структур. Для определения HLA-антигенов необходимы по меньшей мере 3 различные тест-сыворотки, из которых хотя бы 2 дают реакцию 3+. Для титрования HLA используют добавку донорской сыворотки (пул составляет приблизительно 120 человек). Эти сыворотки можно заранее поместить в тест-камеры и сохранять в течение нескольких месяцев при —20 °С под слоем вазелина. Безвазелиновые камеры после внесения в них сыворотки выдерживают на воздухе в течение 1 часа при 22 °С для высыхания сыворотки. В таком виде тест-камеры можно даже пересылать по почте. Перед использованием в каждую лунку вносят по 1 мкл дистиллированной воды и под крышку подкладывают лист влажной фильтровальной бумаги.

Copyright © 2011-2012