Главная

Оценка иммунофлюоресцентных препаратов

Субъективная оценка исследуемых объектов

Если флюоресцирующие объекты оцениваются по контрасту, т. е. по сравнению флюоресценции объекта с флюоресценцией фона, всегда следует учитывать данные отрицательного контроля. Если при отрицательном контроле на соответствующих структурах не наблюдается нежелательной флюоресценции, вопрос решается просто: по типу да/нет. Как правило, приходится сталкиваться с ситуацией, когда необходимо решать, не усиливается ли специфическая флюоресценция нежелательной флюоресценцией (отрицательный контроль). Это означает, что минимально воспринимаемая специфическая флюоресценция зависит от степени неспецифической нежелательной флюоресценции. Вследствие несовершенства органа зрения (адаптация) при незначительном контрасте необходимо чаще прибегать к сравнению с известными препаратами. Если наблюдения ведутся над одним единственным антигеном, интенсивность флюоресценции будет расти пропорционально увеличению концентрации меченых антител, пока не останется свободных детерминант. Если оценивают содержание нескольких антигенов, различных по количеству и по аффинности к меченым антителам, то интенсивность флюоресценции не зависит от концентрации антител в применяемом растворе. Специфическую флюоресценцию можно оценивать по степени интенсивности. Эта система оценки зависит от всех методических и инструментальных факторов, влияющих на контрастность, в том числе от положительного и отрицательного контроля. Становится ясно, что такая система оценки имеет смысл только в пределах одной лаборатории.

Титрование

Одним из вариантов количественной оценки антител в растворах может служить ступенчатое разведение раствора с целью определения максимального разведения, при котором еще наблюдается специфическая флюоресценция. Это разведение принимают за титр антител. Для того чтобы сравнивать результаты с результатами других лабораторий, необходимо время от времени проводить исследования со стандартными сыворотками. Этим способом можно установить разницу в чувствительности применяемых методов и стандартизовать данные поправками титра.

Микрофлюориметрия— микрофотография

Количественная оценка флюоресценции при помощи флюориметрии порождает много проблем. Необходимой предпосылкой является стандартизация метода. Следует стремиться сократить до минимума ошибки и по возможности определить их абсолютное значение (ошибки, связанные с «выцветанием», фокусировкой, толщиной исследуемого объекта). В отличие от адсорбционной микрофотометрии, в которой сравнение производят с данными, получаемыми без объекта исследования, микро-флюориметрия вынуждена использовать флюоресцентный стандарт, чтобы проводить по нему калибровку оборудования и реагентов. Нити уранового стекла, заключенные в пиафлексили энтеллан, могут служить легкодоступными стандартами. Поскольку интенсивность флюоресценции зависит от толщины объекта, то очень трудно проводить сравнение разных срезов (из-за неодинаковой толщины). В этом случае можно воспользоваться соотношением интенсивности флюоресценции различных клеточных структур (контраст) или изменением интенсивности флюоресценции во времени (выцветание). Для документации исследований необходимо делать микрофотографии флюоресцирующих объектов. Следует отметить, что микрофотография не может служить доказательством положительной реакции даже в сравнении с микрофотографией заведомо негативного стандартного препарата вследствие эффекта Шварцшильда (Schwarzshild). Слабая интенсивность освещения всегда вызывает эффект Шварцшильда при микрофотографировании, другими словами делает необходимым добавочное время освещения к автоматически регулируемому времени достижения необходимого усиления окраски. Величина эффекта Шварцшильда, т. е. удлинение времени освещения, зависит от интенсивности флюоресценции, типа пленки и эмульсии. Вследствие этой и других проблем (выцветание, эффект темного поля) необходимо соблюдать следующие условия: применять высокочувствительные сорта фотопленки, например ORWO-RS2, NP27, определять время экспозиции на образцах исследуемой фотопленки, помнить, что установка автоматической регуляции экспозиции не приносит ощутимых преимуществ, так как необходимы пробные испытания с каждой новой серией фотоэмульсии. Ввиду незначительных изменений оптических условий при люминесцентной микроскопии можно производить смену объективов, рассчитывая изменения времени экспозиции заранее. Для цветной фотосъемки можно использовать пленки, применяемые как для съемок при естественном освещении (ORWO chrom UT18), так и при искусственном освещении (ORWO chrom UK17). Пленки для искусственного освещения рекомендуются в тех случаях, когда приходится фотографировать объекты после дополнительного окрашивания синим Эванса или бромистым этидием. Для съемки объектов с монохроматическим флюоресцентным излучением черно-белые пленки используются наравне с цветными.

Источники ошибок

Приводимое ниже перечисление источников возможных ошибок не претендует на исчерпывающую полноту, оно скорее представляет собой выборку из наиболее часто встречающихся вариантов ошибок. Обычно легко путают верхний и нижний, а также правый и левый края предметных стекол. Для предотвращения таких ошибок рекомендуется асимметрично располагать образцы или маркировать предметные стекла всегда в одном и том же углу.

— Долго или неправильно хранившийся конъюгат может вызывать образование флюоресцирующих выпадений по всему субстрату. Опыт повторяют с заведомо пригодной сывороткой.
— Если во влажной камере во время инкубации недостаточно жидкости или камера не препятствует испарению жидкости, может наблюдаться так называемый краевой эффект. Концентрация меченых антител будет большей на периферии и приведет к ложноположительному результату.
— Если было допущено присыхание сывороток или конъюгата к препарату, возникает сильная неспецифическая флюоресценция, которая исключает правильную оценку результатов.
— Если в лаборатории проводят эксперименты с другими флюорохромами, например с акридиновым оранжевым, то даже ничтожные следы этого соединения, попадающие в препарат, могут вызывать флюоресценцию ткани, особенно ядер, приводя к ложноположительным результатам.
— В случае применения высокотитражных сывороток возможно взаимное влияние двух различных препаратов, подвергающихся одновременной отмывке.
— При любом методе окрашивания препаратов с флюорохром содержащими антителами следует пользоваться одним и тем же объективом для получения сравнимых результатов, так как субъективно воспринимаемая интенсивность флюоресценции зависит от апертуры объектива.
— Смеси антител к различным антигенам исследуемого препарата могут давать различного рода искажения ввиду взаимного влияния антител. Например, антимитохондриальные антитела исключают возможность одновременного определения антител к обкладочным клеткам и мешают определению антител к гладкой мускулатуре.

Тенденции развития метода

Наибольший интерес представляют собой две тенденции. В первом случае антиген присоединяют к твердой фазе (сефадекс, пластиковые поверхности), что позволяет улучшить количественную оценку иммунофлюоресценции. Во втором случае предпринимались попытки повысить чувствительность тест-системы без усиления неспецифических реакций. Этого можно достичь присоединением антител к флюоресцирующим частицам, например липосомам, или присоединением антител к промежуточно связывающимся соединениям, например биотину.

Copyright © 2011-2012