Главная

Маркировка иммуноглобулинов

Для получения γ-глобулиновой фракции можно использовать 4—5-кратное переосаждение сульфатом аммония. Избыток соли мешает маркировке и должен быть предварительно удален диализом. Перед маркировкой необходимо также определить реактивность антител и содержание белка в препарате. Практически для всех экспериментов можно в качестве флюоресцирующего красителя использовать ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат). Для двойной маркировки можно использовать добавочное введение ТРИТЦ (тетраметилромадинизотиоцианат). Спектр флюоресценции этих красителей различен. Условия их конъюгирования с Ig одинаковы. Мечение Ig не должно сопровождаться снижением их специфической активности. Увеличение числа молекул красителя, связанных с каждой молекулой Ig, одновременно повышает чувствительность и усиливает неспецифические реакции с таким конъюгатом. Оптимальное молярное соотношение флюорохрбм/Ig составляет 2—3 для ФИТЦ и 1—2 для ТРИТЦ. Известны краткосрочное (2 ч при комнатной температуре) и длительное маркирование (12—18 ч при 4°С), которому мы отдаем предпочтение. После введения метки в молекулу Ig избыток красителя удаляют. Различными видами очистки, например адсорбцией ацетоновым порошком тканей, можно удалить антитело, содержащие наибольшее количество красителя. Рекомендуется для каждого конъюгата определять молярное соотношение краситель/белок.

Маркирование белков ФИТЦ и ТРИТЦ

Материалы и оборудование. ФИТЦ, изомер I (например, фирмы Baltimore Biological, США) или ТРИТЦ; 0,1 М Na2HP04; диметилсульфоксид (ДМСО) (например, Реахим, СССР); карбонат-бикарбонатный буфер с рН 9,5 (17,3 г NaHCOs, 8,6 г Na2C03 в 1000 мл дистиллированной Н20); 0,01 М и ФСБ с рН 7,2 (1,72 г Na2HP04-2H20, 0,5 г КН2Р04, 7,2 г NaCl, дистиллированная Н20 до 1000 мл); 0,01 М фосфатный буфер с рН 7,5; сефадекс G-25 средний (Pharmacia, Швеция); полиэтиленгликоля 20000 (Ferak, Зап. Берлин). Диализный материал, магнитная мешалка, хроматографическая колонка.

Методика. Перед маркировкой раствор белка (концентрация 15—25 г/л) в течение ночи диализуют при 4°С против карбонат-бикарбо-натного буфера. На каждый грамм белка расходуется 12,5 мг флюоресцентного красителя (ФИТЦ, ТРИТЦ), этим достигается оптимальное соотношение краситель/белок. Растворяют 1 мг ФИТЦ в 2 мл 0,1 М Na2HP04, 1 мг ТРИТЦ растворяют в 1 мл ДМСО. Раствор красителя медленно, по каплям, добавляют к раствору белка при постоянном помешивании. Необходимо контролировать и поддерживать рН на уровне 9,3. Конъюгирование продолжается в течение 18 ч при 4 °С в темноте. После окончания процесса избыток красителя удаляют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25. Сефадекс кипятят в течение 4 ч, густую суспензию заливают в колонку, нижнее отверстие которой закрыто нейлоновой сеткой или стеклянной ватой. После того как сефадекс осядет, колонку заполняют и уравновешивают ФСБ. Раствор, содержащий меченые белки и свободный краситель, осторожно наносят на колонку, колонку промывают ФСБ. Меченые белки движутся через сефадекс быстрее, чем свободный краситель, и при прохождении через колонку видны в виде окрашенной полосы. Для концентрирования полученных фракций мы рекомендуем диализ против раствора полиэтиленгликоля (250 г полиэтиленгликоля на 1 л 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,5). Раствор концентрируют до нужной степени и собирают. Колонку с сефадексом можно многократно использовать для фильтрации. В перерывах между работой к раствору, заполняющему колонку, добавляют консервант (мертиолат).

Фракционирование и ориентировочное определение соотношения краситель/белок

Материалы и оборудование. ДЭАЭ-целлюлоза 0,6—0,8 мэкв/г (Ренал, Будапешт), 0,02 М фосфатный буфер с рН 7,5, растворы NaCl (0,1 М; 0,2 М; 0,4 М; 0,6 М; 0,8 М). Маленькая хроматографическая колонка или пластиковый шприц. Спектрофотометр UV vis (Zeiss, Йеиа).

Методика. ДЭАЭ-целлюлозу уравновешивают 0,01 М фосфатным буфером с рН 7,5, заполняют сорбентом колонку. На колонку наносят исследуемую фракцию меченых белков. Вначале колонку промывают буфером без NaCl, затем буферными растворами с возрастающей концентрацией соли (0,05 М; 0,1 М; 0,2 М; 0,3 М; 0,4 М). Растворы для элюции получают смешиванием фосфатного буфера и растворов NaCl в соотношении 1 + 1. Белки, меченые ФИТЦ, сходят с колонки с 0,4 М NaCl, белки, меченые ТРИТЦ, —с 0,05—0,01 М NaCl.

Удаление избыточно меченых антител можно осуществить осаждением протаминсульфатом. Для точного определения количества белка мы рекомендуем пользоваться биуретовым методом. Ориентировочно количество белка можно определить спектрофотометрически, используя в качестве стандарта раствор γ-глобулина. Содержание ФИТЦ определяют, используя в качестве стандарта раствор флюоресциндиацетата. Зная коэффициент экстинкции ФИТЦ и ТРИТЦ, можно определить количество связанного красителя и молярное соотношение краситель/белок.

Ориентировочное определение концентрации белка (Кб) и молярного соотношения краситель/белок (Кр/б)
конъюгатов путем измерения оптической плотности (ОП) на различных длинах волн.
Конъюгаты белок — ФИТЦ разводят 0,1 М NaOH, конъюгаты белок —ТРИТЦ—ФСБ

Ориентировочное определение концентрации белка (Кб) и молярного соотношения краситель/белок (Кр/б)

Адсорбция порошком ткани

Если конъюгат в прямой реакции с тканью дает неспецифическую или нежелательную специфическую флюоресценцию, то адсорбцией конъюгатов порошком соответствущей ткани можно устранить это явление. Этот метод оказался полезным при обработке коммерческих препаратов, дающих перекрестные реакции с тканями различных животных.

Материалы и оборудование. Необходимо иметь свежую мышиную или крысиную печень, ФСБ с рН 7,2 ацетон, гомогенизатор, термостат, марлю.

Методика. Извлекают печень мыши или крысы (промывают ее перед извлечением холодным ФСБ через систему нижней полой вены), измельчают ножницами, затем гомогенизируют.

Гомогенат ткани фильтруют через несколько слоев марли, марлю аккуратно выжимают. К фильтрату при постоянном помешивании добавляют 4-кратное количество ацетона. После центрифугирования (20 мин, 4000 g) осадок промывают дистиллированной водой до полного исчезновения следов гемоглобина. Осадок высушивают ацетоном ,3—5 раз (суспендируют в ацетоне и центрифугируют 20 мин при 2000 g). Порошок сушат в течение ночи при 37 °С, разделяют на порции и хранят без доступа воздуха при 4°С. Адсорбцию проводят, смешивая 50 мг сухого порошка печени с 1 мл конъюгата и инкубируя их в течение 1 ч при комнатной температуре. Порошок ткани удаляют центрифугированием в течение 30 мин при 15000 g. Адсорбированный конъюгат диализуют, разделяют на порции и лиофилизируют.

Хранение сывороток и конъюгатов

Конъюгаты и сыворотки можно хранить без потери ими активности при —20 °С в течение года и более. Повторное замораживание и оттаивание снижает активность в меньшей степени, чем хранение при комнатной температуре или микробный пророст. Порции, на которые разливают препараты при хранении, не должны быть слишком маленькими, иначе происходит холодовое высушивание образцов, которое резко снижает активность. Идеальным способом хранения конъюгатов является лиофилизация и последующее хранение при 4 °С. Сильно разведенные сыворотки или конъюгаты рекомендуется использовать в день разведения. При хранении материала при 4 °С рекомендуется добавлять консервант (мертиолат).

Copyright © 2011-2012